Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

Главной целью этой процедуры является идентификация белковых взаимодействий внутри данного протеома параллельным несмещенным образом, что невозможно с помощью других технологий. Это достигается путем первой гибридизации и мечения эпитопом интересующего вас белка с высокоочищенной, полноразмерной функциональной библиотекой белков, нанесенной в координатной плоскости на поверхность предметного стекла микроскопа. После того, как белок достигает равновесия с каждым из соответствующих белков-мишеней на матрице, несвязанная фракция вымывается, и белковые взаимодействия обнаруживаются с помощью моноклонального антитела к эпитопу, конъюгированному с флуоресцентным фрагментом, с помощью стандартного микрочипового сканера.

Полученные изображения чередуются с информацией об интенсивности каждого признака по отношению к связанному белку и флуоресцентному сигналу. Эта информация экстраполируется с помощью программного обеспечения для анализа микрочипов для создания списка значений интенсивности для каждого элемента массива. Информация о взаимодействующей паре белок-белок может быть экспортирована в последующее программное обеспечение для биоинформатического анализа для оценки специфических данных и идентификации белковых взаимодействий между интересующим белком и белками на микрочипе.

Данные об интенсивности необработанного сигнала компилируются по двум или более белковым микрочипам для учета вариаций между и внутренними анализами, и данные нормализуются для оценки каждого из взаимодействий. Полученный результат генерирует целевой список взаимодействующих белков, который может быть использован для дальнейшего исследования белковых взаимодействий. Функциональный белковый микрочип in vivo был разработан в лаборатории Майкла Снайдера более 15 лет назад.

С тех пор было много успешных применений этой технологии благодаря ее универсальности и биохимическим протеомным анализам. Этот метод облегчает изучение белковых взаимодействий и модульных сигнальных сетей, а также альтернативных связностей и ранее известных сигнальных каскадов Для культивирования и очистки зондов киназы V five используют свежепрорезанный штамм дрожжей Y 2 58, содержащий белковую пластину слияния V five, дрожжи на синтетическом полном урациле, 2% декстрозы агара, и выращивают при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех дней из замороженной культуры. Инокулируйте стартовые культуры из одной колонии и выращивайте в течение ночи в синтетическом полном урациле.

2%-ная декстроза на трясущейся платформе или колесе при 30 градусах Цельсия. На следующее утро привите 400 миллилитров синтетического полного урацила. 2%-ная культура рафинозы с достаточным количеством стартовой культуры для достижения конечной оптической плотности на уровне 600 нанометров или наружного диаметра 600 0,1.

Вырастите инокулюмы до наружного диаметра 600 0,6, затем индуцируйте экспрессию конструкции слияния V пяти киназ, добавив достаточное количество экстракта трех дрожжей. Бодрящий тон с добавлением 6% галактозы для разбавления индукционной среды в три раза или до конечной концентрации галактозы 2%Индуцируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение шести часов на встряхивающей платформе. Используйте двухлитровую колбу Эрленмейера, чтобы обеспечить соответствующую аэрацию.

Соберите клетки, вращая 400 миллилитров клеточной суспензии при 1000 умноженных на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Промойте клетки один раз 50 миллилитров ледяного буфера PBS и переложите в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Промойте гранулу еще раз в ледяном фосфатно-солевом буфере или буфере A PBS и переложите в двухмиллилитровые пробирки с защелкивающимися крышками для лизиса.

После вращения клеток при температуре 20 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия извлеките буфер с помощью пипетки и поместите пробирки на лед. Изложить клетки с 0,5 миллиметровыми шариками диоксида циркония в соотношении один к одному в объеме клеточной гранулы до гранул для лизиса PBS, буфера. Затем трижды перемешайте смесь с помощью платформы для перемешивания с интервалом в две минуты при четырех градусах Цельсия.

Центрифугируйте лизат при 20 000 G в настольной микрофуге в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перелейте осветленный лизат в пробирку, содержащую примерно 100 микролитров предварительно промытой смолы сродства никеля, и инкубируйте на нутате в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Чтобы захватить гистамин шесть x меченых V пять гранул термоядерного белка, смолу используют с помощью настольной центрифуги в течение пяти минут при 1000 G и четырех градусах Цельсия после удаления надосадочной жидкости.

Промойте смолу промывочным буфером в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия на мутаторе. Повторите стирку еще два раза со свежим буфером для стирки. Разбавьте белки двумя 100 микролитровыми объемами 200 миллимолярного оле.

Добавьте глицерин до конечной концентрации 30% образцов и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования в анализе. Для обнаружения взаимодействий. Разведите конъюгированное антитело V five fluoro four до 260 нанограмм на миллилитр в зонде, буферизуйте и тщательно перемешайте путем встряхивания.

Затем разбавьте V-five fusion protein Probe в диапазоне концентраций от пяти до 500 микрограммов на миллилитр. Далее достаньте белковые микрочипы из морозилки и доведите до четырех градусов Цельсия в холодильнике непосредственно перед использованием. Добавьте блокирующий буфер непосредственно в держатель предметного стекла, содержащий белковые микрочипы, и накройте верхнюю часть параформом для предотвращения утечки.

Заблокируйте массивы в блокирующем буфере на один час, встряхивая при 50 RP на сцене при четырех градусах Цельсия. После блокировки перенесите массивы в увлажненную камеру, облицованную плиткой до четырех градусов Цельсия и добавьте 90 микролитров разведенного зонда непосредственно на поверхность массива. Наложите решетки с помощью поднятого лифтера и инкубируйте без встряхивания в увлажненной камере при температуре четыре градуса Цельсия в течение полутора часов После инкубации добавьте предметное стекло в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую достаточное количество предварительно охлажденного буфера зонда, чтобы полностью обхватить слайд, позволяя лифтеру аккуратно соскальзывать с белкового микрочипа.

Промойте массивы три раза по одной минуте каждый в трех конических трубках. Нанесите раствор антитела непосредственно на матрицу сразу после завершения промывки и наложите стертым скользящим атлетиком. Как и раньше, инкубируйте массивы в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия во увлажненной камере.

Выполните ту же стадию промывки, что и раньше, и вращайте в конической трубке объемом 15 миллилитров при 800 G в настольной центрифуге в течение пяти минут. При комнатной температуре массивы высушите на воздухе в держателе слайдов в темноте в течение 30 минут перед сканированием массива с точностью до 647 нанометров. В этом эксперименте была исследована связывающая активность TDA one V five.

Микрочипы дрожжевых белков, обнаруженные в двух экземплярах с примерно 4 200 полноразмерными гибридными белками GST, инкубировали с контролем пустого вектора или с зондами TDA one V five. Панели вставок сравнивают идентичные области в обоих массивах. Особого внимания заслуживает RIM 11, который, что интересно, также был идентифицирован как фосфорилированная мишень TDA 1 в ранее опубликованном исследовании.

После того, как мишени идентифицированы, они могут быть проверены на биохимическую и функциональную активность in vivo. Если вы смотрите это видео, у вас должно быть лучшее понимание того, как использовать функциональные белковые микрочипы в качестве средства идентификации потенциальных белковых взаимодействий белков для дальнейшей валидации и исследования in vivo.