Иммунологический из белков наружной мембраны с помощью проточной цитометрии из изолированных митохондрий

Основная цель этой процедуры заключается в иммуномаркировке представляющих интерес белков на митохондриальной мембране ER антителом по вашему выбору и одновременном анализе с функцией митохондрий. Это достигается путем предварительного сбора интересующих тканей, таких как головной мозг, спинной мозг или печень, у крысы. Второй шаг заключается в выделении митохондрий из тканей, в данном случае спинного мозга.

Спинной мозг гомогенизируется с помощью танца. Гомогенизатор и другие органеллы и остатки клеточного дня удаляют с помощью серии этапов центрифугирования до тех пор, пока не будет достигнут миелин, основной загрязнитель центральной нервной ткани, основной загрязнитель центральной нервной ткани удаляется путем смешивания митохондрий с раствором 12% opti prep и снова центрирования. Затем выделенные митохондрии помечаются первичным антителом выбора, за которым следует вторичное антитело, конъюгированное с фтором.

Завершающим этапом является добавление флуоресцентных красителей для подтверждения митохондриальной идентичности или, скорее, функциональных параметров. В конечном счете, проточная цитометрия используется для отображения относительного обилия митохондриальных альтомембран на протяжении всей нормальной физиологии или заболевания. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микроскопия, заключается в том, что он обеспечивает высокую пропускную способность и быстрое количественное определение тысяч отдельных митохондрий.

Животные, использованные в этом исследовании, лечились в строгом соответствии с протоколом, утвержденным институциональным комитетом C-R-C-H-U-U по защите животных, который следует национальным стандартам, изложенным Канадским советом по уходу за животными в воздухе. Чтобы начать эту процедуру, поместите целый неповрежденный спинной мозг, который был собран у крысы, в стеклянный гомогенизатор объемом пять миллилитров, содержащий пять объемов гомогенизационного буфера. Поместите стеклянный гомогенизатор на лед и гомогенизируйте ткань вручную до тех пор, пока не останутся более крупные кусочки ткани, что займет примерно восемь ударов.

Перенесите гомогенат в две или три микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте при температуре 1,300 G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия, а затем пипетка S-надосадочная жидкость в пятимиллилитровую ультрацентрифужную пробирку. Добавьте в гранулу 750 микролитров гомогенизационного буфера и аккуратно суспендируйте гранулу. Затем центрифугируйте суспензию и снова суспензируйте гранулу.

Еще два раза, чтобы удалить мелкий мусор, втяните все надосадочную жидкость в ту же пятимиллилитровую ультрацентрифужную пробирку, а затем поместите пробирки в ротор ультрацентрифуги. Оснащенные качающимися ведрами, центрифугируйте пробирки при 17 000 умноженных на G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Когда центрифугирование будет завершено, сохраните надосадочную жидкость для дальнейшей обработки, если цитозольная фракция представляет интерес.

Затем ресуспендируйте гранулу, которая представляет собой сырую митохондриальную фракцию в четырех миллилитрах гомогенизационного буфера, содержащего 50 миллимолярную центрифугу хлорида калия. Ресуспендируйте гранулу при 17 000 умноженных на G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ведра, затем выбросьте супинат и осторожно повторно суспендируйте гранулу в 800 микролитрах гомогенизационного буфера в новой пятимиллилитровой ультрацентрифужной трубке ровно на 800 микролитров ресуспензии пеллеты. Затем пипеткой вводят 200 микролитров йод-дала на 800 микролитров ресуспендированной гранулы до создания конечной концентрации 12%-ного йод-дала.

Осторожно, но тщательно перемешайте содержимое пробирки с помощью пипетки P 1000, а затем центрифугируйте при 17 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ведра, аспирируйте слой миелина в верхней части пробирки и осторожно выбросьте супинат, так как палитра может быть рыхлой. Резус суспендирует гранулу в четырех миллилитрах гомогенизационного буфера. Затем центрифугируйте усиление при 17 000 умноженных на G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ведра.

Выбросьте супинат и ресус. Суспензируйте гранулу в четырех миллилитрах гомогенизационного буфера. Затем снова повторите центрифугирование и удалите лежачий агент reus.

Согните готовую гранулу в 100-200 микролитрах гомогенизационного буфера и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитров. Определите количество белка в каждом образце с помощью стандартного количественного анализа белка, такого как анализ бионической кислоты или BCA. При подготовке образцов к количественному определению разбавляйте образцы и стандартную кривую в 2% сульфате натрия, чтобы обеспечить адекватную солюбилизацию митохондрий.

Для каждой тестируемой смеси для окрашивания пипеткой 25 микрограммов выделенных митохондрий в пробирку микроцентров объемом 1,7 миллилитров. Обязательно включайте в каждый эксперимент неокрашенный образец, а также соответствующий контроль изотипа для каждого тестируемого антитела: центрифугируйте каждый образец при 17 000 перегрузках в течение двух минут при четырех градусах Цельсия в настольной микроцентрифуге. Затем удалите супинат и ресуспендируйте изолированные митохондрии в 50 микролитрах митохондриального буфера.

С добавлением 10% BSA, не содержащей жирных кислот, инкубируйте раствор в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, а затем добавьте 20 микрограммов первичного антитела на миллилитр раствора. Инкубируйте изолированные митохондрии с первичным антителом в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы вымыть несвязанное антитело, центрифугируйте каждый образец и выбросьте лежачий натант. Затем аккуратно ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах митохондриального буфера, а затем повторите этап центрифугирования, выбросьте лежачий натант и повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах митохондриального буфера.

Добавьте 0,5 микрограмма вторичного антитела на миллилитр образца. Затем инкубируйте образцы в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия, защищенные от света. Когда инкубация завершена, центрифугируйте каждый образец и выбросьте супинат, содержащий несвязанное вторичное антитело. Риз.

Суспензируйте гранулу в 200 микролитрах митохондриального буфера и центрифугируйте образец. Снова. Затем снимите супинат и Риз. Суспендируйте гранулу в 500 микролитрах митохондриального буфера, чтобы убедиться, что наблюдаемые события на самом деле являются митохондриями.

Окрасьте образец специфическим для митохондрий флуоресцентным красителем, таким как MIT tracker green из Vitrogen, на 15 минут в темноте. Если для исследования других функциональных параметров дальнейшее окрашивание не требуется, то перенесите меченый образец в пробирку, пригодную для загрузки в проточный цитометр. Держите образцы на льду и перейдите к проточному цитометру для сбора, чтобы убедиться, что выделенные митохондрии имеют неповрежденный трансмембранный потенциал, окрасьте митохондрии метиловым эфиром 100 наномолярного тетраэтилового стержня домина в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте в качестве контроля для окрашивания тетраэтилстержневым домином.

Метиловый эфир окрашивают выделенные митохондрии 100 наномолярными тетраэтилстержневыми доминами метилового эфира в присутствии 100 микромолярного карбонильного цианида м хлорфенола HydroOne. Это химическое вещество является митохондриальным разъединителем и деполяризует митохондрии, чтобы убедиться, что изолированные митохондрии производят супероксидное окрашивание митохондрий соответствующим индикатором супероксида, таким как митозы, носки красного цвета в Vitrogen в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте в качестве контроля производства митохондриального супероксида. Оставайтесь в изолированных митохондриях с красителем в присутствии 10 микромолярного антимицина.

Антимицин А является ингибитором комплекса три дыхательной цепи и увеличивает выработку митохондриального супероксида до начала приобретения. Настройте прибор так, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем перемешайте образцы, слегка постукивая по пробирке, но не делайте завихрения.

Начните сбор исходных данных при низком давлении во время стробирования. Убедитесь, что вы указали на общую численность населения. Далее соответствующим образом отрегулируйте напряжения гистограмм.

Пик неокрашенного образца обычно соответствует второй декаде. Затем, когда ворота установлены и образцы обрабатываются, переключите давление на высокопоточную цитометрию. Анализ препаратов спинного мозга показал, что 94% событий были положительными на специфический для митохондрий краситель.

В этом эксперименте 30% положительных событий в митохондриях были помечены антителом, специфичным для слияния MIT 2, которое является белком, участвующим в слиянии внешней мембраны митохондрий. Анализ митохондриального трансмембранного потенциала с использованием метилового эфира тетраэтилрумина показал, что 95% выделенных митохондрий имеют интактный трансмембранный потенциал. Было показано, что это окрашивание является специфичным, поскольку значительное снижение окрашивания наблюдалось при выполнении в присутствии митохондриального нефункционального митохондрий, которые продуцировали базальное количество оксида SUP, измеренное с помощью мембранного проницаемого красителя.

Это приводит к флуоресцентной реакции P с оксидом SUP. Обработка митохондрий антимицином А приводит к увеличению производства супероксида примерно на 10% после освоения. Эту технику можно выполнить за шесть-семь часов, если она выполнена правильно.