Высокая пропускная Титрование люциферазы экспрессирующих рекомбинантные вирусы

Общая цель данного эксперимента заключается в оценке титров вируса, меченного люциферазой, с использованием метода количественного определения с высокой пропускной способностью. Это достигается путем переноса надосадочной жидкости образцов, подлежащих титрованию, а также вирусной стандартной кривой на разрешающую клеточную линию, чтобы обеспечить экспрессию люциферазы. В качестве второго шага к исходным образцам может быть добавлен зурин RESA, который будет использоваться для оценки жизнеспособности клеток.

Затем, по прошествии соответствующего времени инкубации, люцифериан добавляют в клетки для количественного определения с помощью люминесценции. Результаты показывают количество вируса в образце на основе экспрессии люциферазы. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как титрование бляшек, заключается в том, что большое количество образцов можно обрабатывать быстро и одновременно.

Этот метод также может быть распространен на вирусы, экспрессирующие люциферазу, не клацящие. Поскольку он не зависит от образования бляшек, считывание цитотоксичности клеток может быть легко включено в рабочий процесс и может быть полезным в контексте скрининга лекарственных средств. Демонстрировать процедуру будут Ванесса Рамиа и Колин, три аспиранта из моей лаборатории.

Супернатанты тканевых культуральных планшетов из этих планшетов будут титроваться после соответствующего времени инкубации за 24 часа до титрования. Приготовьте суспензию клеток Vero в концентрации 2,5 раза по 10 до пятой клетки на миллилитр в DMEM, содержащую 10% FBS 30 миллимолярных куч и 1% пенициллина стрептомицина С, в 2,5 раза по 10 до четвертой клетки в 96. Хорошо белые, твердые плоские донные пластины с помощью микропланшетного дозатора для приготовления клеточной суспензии, очистите микропланшет диспенсера кассеты, промыв трубку 50 миллилитрами стерильной воды.

Затем заполните линии дозатора микропланшетов клеточной суспензией, позволяя протекать пяти миллилитрам клеточной суспензии. Выберите программу, которая будет выдавать 100 микролитров в каждую лунку 96-луночной пластины с белыми стенками, и повторяйте при необходимости для дополнительных пластин. Также засейте несколько лунок в 96 лунки с прозрачным белым дном для проверки здоровья и плотности клеток.

Когда закончите, промойте ячейки обратно в исходный контейнер. Очистите кассету, пропустив 50 миллилитров 70% этанола, а затем 50 миллилитров теплой стерильной воды через трубку. После этого инкубируйте клетки в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с содержанием углекислого газа 5%.

Подготовьте стандартную кривую VSV Delta 51 в сыворотке крови DMEM таким образом, чтобы конечная концентрация платформенных единиц на миллилитр после переноса на клетки Vero была следующей. Приготовьте 50 микролитров каждой концентрации на планшет с клетками Vero, плюс дополнительные 10%. Затем проверьте клетки Vero, помещенные в прозрачную нижнюю 96-луночную пластину под световым микроскопом, чтобы убедиться, что монослои содержат не менее 95% конфлюентного транстрансфера.

25 микролитров надосадочной жидкости образца на клетки Vero, помещенные в планшеты с белыми стенками, с помощью 12-канального многоканального пипеттера по 25 микролитров каждого разведения стандартной кривой на клетки Vero в двух обозначенных колонках. Центрифугируйте планшеты в течение пяти минут при давлении 430 G при комнатной температуре. Затем инкубируйте планшеты в течение пяти часов при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа.

На этом этапе добавьте зурин в количестве, равном 10% от объема в каждую лунку из 96-луночной пластины образцов, содержащих вирус и клетки. Через два-четыре часа считайте и запишите сигнал с помощью считывателя флуоресцентных пластин, использующего от 530 до 560 для возбуждения и 590 для отчета об излучении. Жизнеспособность клетки для образца по следующей формуле.

За 30 минут до окончания пятичасовой инкубации приготовьте Люцифер для получения раствора в концентрации два миллиграмма на миллилитр в стерильном фосфатном буферном растворе. Защитите раствор от света после пятичасового инкубационного периода по 25 микролитров Люцифера в каждую лунку клеток Vero в белых твердых пластинах с помощью автоматического дозатора, встроенного в люминометр. Ознакомьтесь с табличками со следующими параметрами.

Встряхните в течение пяти секунд и подождите 30 секунд. Считывание люминесценции при соответствующем значении воздействия с фиксированной чувствительностью, а затем запись и сохранение количественной интенсивности биолюминесценции. Если для добавления люцифериана, расположения люцифериана и заполнения линий стерильной водой или получением точных результатов используется автоматический дозатор, решите нелинейную регрессию, чтобы получить уравнение холма из стандартных кривых.

Примените это уравнение к титрованным образцам, чтобы вычислить единицы экспрессии вируса. Здесь показаны результаты типичной стандартной кривой VSV Delta 51, или же с помощью параметрического нелинейного регрессионного анализа был построен график града, из которого можно интерполировать неизвестные единицы формирования входа. Титры вируса, полученные с помощью стандартного анализа бляшек на клетках Vero, сравнивали с рассчитанными титрами вируса из тех же образцов.

Титрованные с использованием высокопроизводительных образцов для анализа люциферазы были получены в результате эксперимента, в котором различные химические вещества использовались для усиления репликации и распространения клеток VSV Delta 51 и 7 8 6 0. Здесь показана линейная корреляция между титрами и единицами экспрессии вируса с R-квадратом 0,8083 и оценкой Pearsons R 0,899. Здесь приведены типичные данные о цитотоксичности клеток, полученные в результате метаболического анализа, для 7, 8, 6, 0 клеток, обработанных химическими веществами до инфицирования.

При использовании VSV Delta 51 здесь показаны типичные стандартные кривые, полученные с вирусом простого герпеса, вирусом коровьей оспы и аденоассоциированным вирусом, экспрессирующими люциферазу светлячков. После освоения этого метода его можно использовать для проведения высокопроизводительного скрининга библиотек соединений в сочетании с интересующим вирусом для получения титров и данных о цитотоксичности. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о правильном разбавлении стандартной кривой, так как это имеет решающее значение для интерполяции единиц экспрессии вируса.

Не забывайте, что работа с живыми вирусами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в шкафу биологической безопасности и ношение соответствующих средств индивидуальной защиты. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценивать титры вирусов с помощью метода количественного определения высокой пропускной способности, основанного на измерении биолюминесценции трансгена люциферазы при интерполяции неизвестных единиц экспрессии вируса. По стандартному образцу кривой цитотоксичность может быть одновременно определена с помощью соответствующего анализа жизнеспособности.