Рекомбинантный белок Выражение для структурной биологии в НЕК 293F суспензии клеток: роман и доступного подхода,

Общая цель данного видео – продемонстрировать простую и доступную технику получения хорошего выхода белка или белковых комплексов с использованием системы экспрессии у млекопитающих. Это достигается путем культивирования клеток HEC 2 93 F во взвешенном состоянии во влажном встряхивающем инкубаторе с атмосферой, поддерживаемой на уровне 5% углекислого газа. На втором этапе клетки временно трансфицируют одной или несколькими плазмидами с высоким числом копий.

С помощью трансфективного агента полиэтилена EIN или PEI клеткам давали расти в течение 48 часов перед сбором. Затем проводится очистка белков с помощью аффинной смолы с последующей фильтрацией гелем для очистки интересующего белкового комплекса с целью проведения структурных и функциональных исследований. В конечном счете, эта доступная и простая система экспрессии у млекопитающих позволяет экспрессировать и очищать белки и белковые комплексы, которые трудно экспрессируются в бактериальных клетках.

Основным преимуществом такого подхода является его удобство и универсальность для экспрессии белковых комплексов. Это почти так же просто, как создание белков в бактериях, тем более что вы можете смешивать и сочетать векторы экспрессии белков. Метод первоначально может быть использован в небольших масштабах для проверки экспрессии белковых компрессов, но он легко масштабируется для получения хорошего выхода белковых компрессов.

Так как антибиотики в среде сильно снижают выход белка. Для начала извлеките из жидкого азота криофлакон, содержащий один миллилитр клеток HEC 2 9 3 F с плотностью 20 миллионов клеток на миллилитр и быстро разморозьте на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Разбейте комки, проведя пипетированием вверх и вниз несколько раз, и сдайте все содержимое пипеткой в коническую колбу для клеточных культур объемом 250 миллилитров, содержащую 34 миллилитров предварительно подогретой среды.

Поместите культуру в увлажненный орбитальный встряхивающий инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия, 120 об/мин и 5% углекислом газе через 48 часов. Проверьте жизнеспособность клеток по триану синему. Окрашивание нормальной жизнеспособности клеток на этой стадии составляет примерно 70%, когда количество клеток достигает примерно 1 миллиона клеток на миллилитр.

Массирующими движениями вмассируйте их до конечного подсчета 0,35 миллиона клеток на миллилитр в коническую колбу для клеточных культур объемом 250 миллилитров, содержащую 60 миллилитров предварительно подогретой среды, продолжайте массировать клетки каждые 48 часов или когда они достигнут показателя примерно 2 миллиона клеток на миллилитр. Здесь показан образец окрашивания трианским синим HEC 2 9 3 F-клеток в концентрации 2,3 миллиона клеток на миллилитр из запаса, готового к посеву для трансфекции, клетки должны присутствовать только в виде одиночных или делящихся клеток. Если клетки разрастаются, они образуют большие скопления и будут иметь очень низкую жизнеспособность, как показано на этом рисунке.

Если клетки образуют кластеры, они могут быть разрушены путем энергичного вихряния в течение 25 секунд. Чтобы начать крупномасштабные культуры, засейте клетки из расчета полмиллиона клеток на миллилитр в конечный объем 300 миллилитров в каждой литровой бутылке. Инкубируйте в течение 24 часов в увлажненном орбитальном шейкере при температуре 37 градусов Цельсия, 135 об/мин и 5% углекислого газа, пока клетки не достигнут плотности 1 миллион клеток на миллилитр.

Затем пипеткой наберите в общей сложности 300 микрограммов стерилизованной фильтром ДНК в 30 миллилитров фосфатно-солевого буфера или PBS и энергично перемешайте в течение трех секунд. Затем добавьте 1,2 миллилитра по 0,5 миллиграмм на миллилитр. Отфильтруйте стерилизованный PEI до раствора PB SDNA и энергично перебейте еще три секунды.

Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 20 минут перед добавлением смеси в клетки после кроватки. При трансфекции клетки инкубируются в увлажненном орбитальном встряхивающем инкубаторе в течение последующих 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия, 135 оборотах в минуту и 5% углекислого газа через 48 часов. Соберите внутриклеточные белки, центрифугируя клетки при 3000-кратном G в течение пяти минут.

Если клеточная гранула не предназначена для немедленного использования, ее можно хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Этот протокол оптимизирован для очистки белковых комплексов от ядра, в котором один из белков имеет флаговую метку. Чтобы начать очистку, суспендируйте клеточную палитру примерно в 40 миллилитров предварительно охлажденного лизиса, буфер на литр культуры, используя комбинацию пипетирования вверх и вниз несколько раз, и стеклянный гомогенизатор ультразвуком в течение трех циклов по 15 секунд при 15-секундном выключении.

Затем центрифугируйте 108 000 раз G в течение 25 минут при четырех градусах Цельсия и удерживайте натант в положении лежа. Затем уравновесьте 1,2 миллилитра смолы в упаковке Anti-Flag на литр культуры путем трехкратной промывки буфером для уравновешивания смолы, инкубируйте супинат, который представляет собой весь клеточный экстракт с аффинной смолой, в одной или нескольких 50-миллилитровых центрифужных пробирках, осторожно вращая в течение 30-120 минут при температуре четыре градуса Цельсия после инкубации центрифугой при 3000 умноженных на G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. После удаления супината перелейте смолу в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и промойте в общей сложности 45 миллилитров предварительно охлажденного буфера, перед этим центрифугируете, а затем выбросьте супинат, повторите промывку и центрифугирование с использованием буфера с высоким содержанием солей, за которым следует буфер с низким содержанием солей и буфер для расщепления TEV.

Убедитесь, что каждой промывки достаточно для полной ресуспендирования смолы, но не более. Затем соберите образец смолы объемом 10 микролитров и разбавьте в одном объеме буфер для загрузки белка в два раза больше белка для анализа, чтобы представить образец связанного белка. Не используйте восстановители, так как они высвободят антитела из смолы.

Затем ресуспендируйте смолу в 10 миллилитров предварительно охлажденного буфера для расщепления TEV в концентрации примерно 40 мкг протеазы TEV на литр исходной культуры и перемешайте, несколько раз перевернув трубку. Уровни протеазы TEV могут быть оптимизированы в соответствии с количеством экспресс-белка. Замените атмосферу трубки на 100% газообразный азот, чтобы предотвратить окисление белка, прежде чем осторожно вращаться в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день.

Центрифугируйте образец при 3000 умноженных на G в течение 10 минут, затем перенесите супинат в ультрацентробежный фильтр с соответствующей молекулярной массой и сконцентрируйте до 500 микролитров. Соберите образец концентрированного белка объемом 10 микролитров и разведите в один объем в два раза больше белкового буфера для анализа. Этот образец представляет собой образец TEV eluate.

Затем соберите 10 микролитров образца смолы и разведите в один объем в два раза больше белка для загрузки буфера. В этом образце представлен образец смолы после TEV. Следующим шагом является прогон белка через колонку исключения размера, и следует использовать соответствующую матрицу для фильтрации геля в соответствии с размером интересующего комплекса.

В данном случае мы использовали колонку для эксклюзионной хроматографии размером 10 на 300 мм S 200, приравнивающую колонку для эксклюзионной хроматографии к гелевому фильтрационному буферу. Отфильтруйте белок через фильтр 0,22 микрона и загрузите образец в колонку. Продолжайте собирать дроби по мере того, как они отрываются от столбца.

В качестве заключительного этапа проводят электроферез в полиакриламидном геле SDS или SDS page на собранных образцах, а также фильтруют фракции геля, гистонов DS SLA one или HD один супрессор дефектного сайленсинга три или SDS три и syn три, домен взаимодействия HDAC или syn три, A HID образуют устойчивый терновый комплекс. Аффинную очистку тернистого комплекса можно наблюдать на странице SDS. Здесь показан очищенный комплекс, производимый cot, пересекающий два литра клеток.

Полоса связанного белка показывает комплекс, связанный со смолой сродства. После расщепления TEV метка, присутствующая на грехе три A HID, отщепляется, и на комплекс намекают. Показанная здесь смола представляет собой хроматограмму белкового комплекса, очищенную с помощью эксклюзионной хроматографической колонки размером 10 на 300 мм S 200.

Обратите внимание, что чистый комплекс ускользает близко к объему пустоты, потому что в растворе он образует димер. Наконец, анализ страницы SDS выявляет очищенный белок во фракциях фильтрации геля. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выращивать, поддерживать и выращивать суспензию котрана из двух и трех клеток приложения, а также как аффинировать, очищать и концентрировать белок.

Здоровые клетки будут иметь важное значение для успеха экспериментов, поэтому убедитесь, что они выращиваются и поддерживаются в своих условиях и регулярно проходят. Не пугайтесь бактериологического исследования тканей. Структурным биологам легко экспрессировать и очищать большое количество белка и белковых комплексов из клеток млекопитающих.