In Vitro Модель для изучения клеточной патофизиологии в глобоидных Cell Leukodystrophy

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать уникальную трансформацию микроглии в клетки GLO в присутствии токсина циклина. Это достигается за счет первого покрытия покрывающих белков внеклеточного матрикса. На втором этапе глиальные клетки наносятся на покровные листы, а затем в культуры вводятся шарики циклина и латекса.

На заключительном этапе клетки окрашиваются с помощью иммунохимии. В конечном счете, влияние циклина на зарождение и фагоцитарную способность клеток микроглии может быть оценено с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как использование микроглиальных клеточных линий, заключается в том, что использование первичных глиальных культур имитирует гипотетические взаимодействия между астроцитами I и микроглией в мозге людей с лейкодистрофией пустотных клеток GLO или GLD. Демонстрируя эту процедуру, будет К. О. Клейкомб, аспирант из моей лаборатории.

Чтобы приготовить покровные листы, покрытые внеклеточным матриксом или покрытием ECM, сначала замочите круглые покровные листы стерильной соляной кислотой в стерильной чашке Петри. Через 30 минут трижды промойте чехлы стерильной водой, а затем замочите их в 95% этаноле не менее чем на 20 минут. После того, как покровные стекла высохнут на воздухе, добавьте от 150 до 250 микролитров разбавленных материалов для покрытия из белка ECM на лист параформы, распределяя капли так, чтобы покровные стекла не накладывались друг на друга после размещения.

Затем с помощью щипцов аккуратно наденьте защитное стекло на каждую каплю, а затем поместите параформу внутрь колпака для клеточных культур с закрытой створкой через четыре-шесть часов, поместите защитные стекла с покрытием ECM вверх в отдельные лунки 24-луночного планшета. Затем промойте каждую лунку стерильным PB S3 раза и храните крышки при температуре четыре градуса Цельсия. Для подготовки глиальных клеток к нанесению на покровные стекла отсасывают среды из культур глиальных клеток, а затем аккуратно трижды промывают монослои 10 миллилитрами стерильного PBS.

Отделите клетки от восьми до 10 миллилитров трипсина ЭДТА через пять-10 минут. При температуре 37 градусов Цельсия добавьте в колбу 20 миллилитров готовой среды, чтобы остановить реакцию. Затем переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 миллилитров и раскрутите клетки вниз в течение 10 минут.

При 300 G и комнатной температуре используйте P 1000, чтобы аккуратно восстановить небо в двух миллилитрах свежей цельной среды. После подсчета разбавьте ячейки примерно до одного умноженного на 10 до пятой клетки на миллилитр. Теперь нанесите 500 микролитров ячеек на каждую из крышек с покрытием ECM.

Добавьте в каждую лунку дополнительную свежую полноценную среду, а затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти дней. Как только клетки достигнут желаемого слияния, добавьте свежеприготовленный циклин в каждую лунку и аккуратно перемешайте культуральную пластину для перемешивания. После недели лечения циклином соберите среды и зафиксируйте клетки в 500 микролитрах холода, 4% параформальдегида на лунку при комнатной температуре.

Затем промойте каждую лунку три раза PBS и храните тарелки при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы визуализировать клетки GLO с помощью иммуноцитохимии, сначала замените PBS блокирующим буфером и инкубируйте клетки при комнатной температуре. Через час инкубируйте клетки в первичных антисыворотках против маркера микроглии IO One в течение не менее одного часа при комнатной температуре, а затем трижды промывайте каждую лунку в PBS в течение пяти минут.

После инкубации клеток с соответствующей флуоресценцией конъюгированными вторичными антителами контрокрашивают клетки DAPI для идентификации ядер. Затем, после промывки клеток, как показано выше, используйте монтажную среду для крепления каждого защитного стекла на отдельные предметные стекла микроскопа и просмотрите стекла на флуоресцентном микроскопе для визуального и количественного анализа. Для оценки фагоцитарной активности микроглии, обработанной циклином, после лечения циклином, но перед фиксацией, добавляйте меченые FITC латексные шарики в каждую культуру клеток G OID в соответствии с инструкциями производителя и инструкциями.

Через 48 часов зафиксируйте клетки в PFA, как только что продемонстрировано, а затем обработайте клетки для иммунохимии, как показано на рисунке. Наконец, оцените количество IBO одной положительной микроглии, которые локализуются вместе с флуоресцентно мечеными бусинами, с помощью флуоресцентной микроскопии иммунохимической. Окрашивание микроглии с помощью IO one в сочетании с ядерным противоядным окрашиванием позволяет идентифицировать большие округлые многоядерные клетки.

Обратите внимание, что во многих случаях значительное увеличение размера ядра отражает многоядерный статус этих клеток, как видно на этом изображении, лечение циклином также вызывает генерализованную активацию микроглии, которая измеряется увеличением кислотной активности PHA одноядерной микроглии, а также многоядерных клеток GLO. Как видно на этом репрезентативном изображении, кислотно-активные профили PHA положительной микроглии IBO one могут быть легко идентифицированы во время совместного культивирования с клетками-предшественниками олигодендроцитов. Применение этого метода распространяется и на терапию ГЛБД, поскольку образование этих многоядерных клеток в ответ на лечение циклином является определяющей характеристикой невропатологии ГЛБД, и вклад этих клеток в эту патологию ранее не изучался таким образом.