Коллекция, Изоляция и проточной цитометрии анализа человеческой Endocervical образцов

Общая цель этой процедуры заключается в выделении мононуклеарных клеток шейки матки из эндоцервикального соскоба с помощью цитощетки. После выделения эти клетки можно использовать в нескольких анализах, включая проточную цитометрию, где можно определить фенотип и функцию иммунных клеток в женских половых путях. Забор образцов цитощетки и промывания шейки матки является неинвазивной процедурой, которая должна выполняться гинекологом или квалифицированным врачом.

Сначала проводится шейный вагинальный лаваж, при котором эндоцервикс промывается двумя фрезами PBS, который затем собирается из заднего свода после лаважа. Вогнутый конец скребка для шейки матки прижимается к шейке матки и поворачивается для взятия образца цервикального отверстия или шейного отверстия. Далее цитощетка вводится в эндоцервикальную ОС и поворачивается на 360 градусов.

Использование щадящего давления поможет избежать загрязнения образца кровью. Цитощетки в скребке собираются в пробирку, содержащую пять мил PBS. После транспортировки на льду образец быстро превращается в вихрь, чтобы отделить клетки от кисти цито.

После того, как вы промыли образцы фильтрующим материалом, они фильтруются через нейлоновый фильтр толщиной в сто микрон. Это позволяет собрать лимфоциты, моноциты и эпителиальные клетки из образца. Теперь клетки готовы к окрашиванию антителами против поверхностных белков, и как только они будут зафиксированы, их можно запускать на проточном цитометре.

Мы покажем вам, как мы анализируем полученные данные для оценки фенотипа популяций CD 4 и CD 8, присутствующих в шейке матки. Здравствуйте, я аспирант в лаборатории доктора Кита Фолка. Наши исследования сосредоточены на связи между иммунной активацией и восприимчивостью к ВИЧ, а также прогрессированием заболевания.

Поскольку большинство случаев ВИЧ-инфекции в настоящее время происходит через гетеросексуальные контакты, мы также заинтересованы в определении корреляций защиты от передачи ВИЧ через женские половые пути. К сожалению, сбор образцов из половых путей может быть очень сложным, а также довольно инвазивным для участников исследования. Использование цито-щеток для сбора КМЦ или мононуклеарных клеток шейки матки является более быстрым и простым методом по сравнению с другими протоколами, такими как биопсия.

В этом видео мы покажем вам, как выделить и подготовить CMC для использования в проточной цитометрии или других последующих приложениях. После сбора кисть и скребок транспортируются в пяти милах холодного PBS. Важно транспортировать образцы на льду до момента обработки, которое должно быть не более двух часов после сбора пробы.

Любые образцы, которые на данный момент загрязнены следами крови, должны быть исключены из дальнейшего анализа для диссоциации клеток из цитощетки. Поверните трубку на высокий уровень в течение 45 секунд, потому что клетки все еще останутся на кисти и скребке. Их необходимо удалять вручную.

Наденьте свежую пару перчаток и с помощью кисти соскребите остатки материала со скребка. После слива в раствор отбеливателя большим и указательным пальцами удалите все оставшиеся клетки из кисти цитоки, сжимая вверх и вниз пробирку с соколом. После того, как вы выбросите кисть цитоки, смените перчатки перед подготовкой следующего образца, используйте трансферную пипетку, чтобы промыть стенки пробирки PBS, убедившись, что весь образец собран.

Подходит нейлон на сотню микрон. Отфильтруйте свежую пробирку Falcon и с помощью пипетки отфильтруйте весь объем раствора PBS. Добавьте пять мил носителей RPMI без FBS к исходной трубке.

С помощью пипетки тщательно промойте стенки пробирки, чтобы удалить прилипшую слизь или мусор. Затем пропустите носитель через фильтр. Используйте немного отфильтрованного материала для промывки нижней части фильтра перед тем, как выбросить его в отбеливатель.

Для гранулирования выделенных клеток. Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 1500 r pm, чтобы предотвратить смещение гранулы. Не забудьте выключить тормоз центрифуги, если клетки будут использоваться для проточной цитометрии.

Приготовьте блокирующий раствор, необходимый для предотвращения связывания неспецифических антител. На этапе центрифугирования используйте 100 микролитров блокирующего раствора на один образец. Блокирующий раствор содержит 93,2 микролитра факса, промывки или PBS плюс 2% FBS, пять микролитров FBS и 1,8 микролитра мышиного IgG.

После вращения большинство образцов с жизнеспособными клетками будут иметь видимую гранулу. В некоторых случаях гранула будет довольно крупной. В то время как в других образцах он может быть едва заметен.

Размер гранул не всегда связан с выходом клеток. Осторожно наклоните надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы не потревожить клетки, ресуспендируйте гранулу путем легкого перемешивания. Промойте клетки пятью милами PBS и повторите центрифугирование в течение 10 минут при 1500.

РРЦ М с отломом еще раз сцеживаем надосадочную жидкость и повторно суспендируем гранулу как и раньше. На этом этапе клетки готовы либо к криоконсервации, либо к поверхностному окрашиванию перед окрашиванием С флуоресцентными антителами полезно блокировать неспецифическое связывание путем инкубации клеток с блокирующим раствором, приготовленным во время более раннего центрифугирования. После того, как клеточная гранула будет ресуспендирована, добавьте в пробу сотню микролитров блокирующего раствора и тщательно перемешайте.

Остальные этапы протокола могут быть выполнены либо в 96-луночном планшете, либо в факсимильной трубке. В зависимости от размера гранулы КМЦ. Перенесите блокирующий раствор и смесь ячеек на факсимильную трубку.

Инкубируйте образец в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Во время 10-минутной инкубации приготовьте краситель жизнеспособности, который будет использоваться для различения живых и мертвых клеток. Во время анализа данных приготовьте краситель на жизнеспособность в соответствии с указаниями производителя и предварительно титруйте по мере необходимости.

Обязательно держите смесь красителей закрытой от света до тех пор, пока она не будет готова к использованию. После 10-минутной инкубации промойте клетки 500 микролитрами факса, промойте или PBS 2% FBS, а затем центрифугируйте в течение 10 минут при 1600 об/мин. После отжима сцедите надосадочную жидкость из факсимильной трубки.

Повторно подвешивайте клетки путем перемешивания. Теперь добавьте соответствующий объем красителя на жизнеспособность, который был приготовлен ранее. Инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы образцы оставались закрытыми от света, завернув в фольгу.

Во время этой инкубации вы можете приготовить мастер-смесь флуоресцентных антител, которая будет использоваться для мечения клеток. Обязательно предварительно титруйте и проверьте антитела на контрольных образцах периферической крови перед использованием их на КМЦ. Смешайте титруемые антитела и доведите до конечного объема в сто микролитров на образец.

С помощью факса, промывки, защитите все антитела от света во время этих этапов. После 30-минутной инкубации еще раз промойте образец 500 микролитрами факса, промойте, центрифугируйте, сцедите и повторно суспендируйте клетки, как и раньше. Теперь пришло время инкубировать клетки со 100 микролитрами коктейля антител, приготовленного во время предыдущей инкубации.

Еще раз инкубируйте образцы в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия, убедившись, что они защищены от света. Теперь инкубационные CMC готовы к промывке 500 микролитрами PBS в последний раз. Центрифугируйте образец при 1600 об/мин в течение 10 минут.

После сцеживания и ресузирования суспензии гранулы разводят клетки в конечном объеме 750 мкл в 1%-ном растворе паральдегида. Чтобы их закрепить, важно ресуспендировать клетки в этом большом объеме, чтобы не допустить засорения проточного цитометра. Даже при таком объеме пробирка с образцом может казаться довольно мутной.

Держите клетки в темноте при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут обнаружены проточным цитометром. В дополнение к образцу цитовой кисти, мы обычно собираем два мила PBS лаважа из шейки матки и влагалища. Этот образец центрифугируется при 1400 об/мин в течение семи минут для удаления клеточного мусора из промывания воды.

Оставшаяся надосадочная жидкость может быть затем выделена и заморожена при температуре минус 80 градусов Цельсия для будущего анализа концентрации растворимого белка. Эти данные могут быть особенно полезны в сочетании с данными клеточного фенотипа, полученными с помощью проточной цитометрии. Перед запуском образца CMC.

Полезно подготовить элементы управления PBMC для помощи в стробировании компенсационных трубок, используя шарики или одиночные пятнающие элементы для корректировки спектрального перекрытия. Получите всю трубку CMC, чтобы собрать все события по сравнению с образцами PBMC. КМЦ будут демонстрировать больше дублетов на участке площади FSC по сравнению с высотой и могут не демонстрировать такую характерную популяцию лимфоцитов, как pbmc.

После получения образцов экспортируйте файлы для анализа в такую программу, как FlowJo. Здесь мы покажем основные компоненты типичной стратегии стробирования для CD 4 положительных и CD 8 положительных Т-клеток, полученных из CMC. Используйте график зависимости площади FSC от высоты до G на синглетах в образце.

В этом сопоставленном сравнении вы можете ясно увидеть увеличенное количество дублетов в выборке CMC по сравнению с p BMC. Далее, построение графика флуоресцентного маркера или FSC в зависимости от времени служит этапом контроля качества. Если какие-либо изменения скорости потока внесли артефакты в данные, их можно удалить на этом шаге.

В верхней части вы можете увидеть постоянный профиль флуоресценции во времени, указывающий на высокое качество образца. Ниже вы можете увидеть образец с множественными прерываниями и расходом, который можно исключить из дальнейшего анализа. Идентификация популяции лимфоцитов в образцах КМЦ может быть сложной задачей.

Использование контроля A-P-B-M-C поможет с постановкой походки. Как вы можете видеть, некоторые образцы демонстрируют большие прозрачные популяции, в то время как в других образцах отсутствуют популяции лимфоцитов. В целом эти образцы должны быть исключены.

Хотя мы сосредоточимся на популяциях лимфоцитов. Также возможно g на моноцитах путем гейтирования на клетках, у которых отсутствует экспрессия маркеров линии. Можно идентифицировать клетки, которые экспрессируют комбинации дендритных клеток и моноцитарных маркеров, таких как CD 16 и CD 11 C. Включение маркера жизнеспособности или красителя имеет решающее значение для анализа CMC даже на свежих клетках.

Как видите, большинство лимфоцитов КМЦ жизнеспособны, но некоторые образцы содержат высокие частоты мертвых клеток, которые должны быть исключены из анализа. Мертвые клетки могут неспецифически поглощать антитела и искажать анализ данных в пути лимфоцитов. Окрашивание CD three должно быть прочным.

Доля CD-трех положительных Т-клеток ниже и более вариабельна, чем в образцах PBMC, поэтому крайне важно получить весь образец CMC и максимально увеличить количество собранных событий. Популяции CD 4 положительных и CD 8 положительных Т-клеток могут быть идентифицированы так же, как и в образцах TBMC. В некоторых образцах CMC.

Соотношение CD 4 к CD 8 ниже, чем наблюдается в периферической крови, и у некоторых людей наблюдается большая популяция двойных отрицательных Т-клеток. После идентификации CD четырех положительных и CD восьми положительных популяций Т-клеток можно количественно оценить экспрессию многочисленных фенотипических маркеров. Несмотря на то, что экспрессия CD 1 61 может быть обнаружена в КМЦ, светлая популяция CD 1 61, которая проявляется в крови, отсутствует в половых путях.

Аналогичным образом, экспрессия маркеров активации, таких как CD 69 и H-L-A-D-R, а также маркеров, таких как CCR 5 и PD one, может быть надежно измерена среди образцов CMC и количественно определена. Использование образцов цитокистов позволяет охарактеризовать как фенотип, так и функцию иммунных клеток слизистой оболочки, особенно в контексте инфекционных заболеваний. Это не только дает нам более глубокое понимание механизмов, регулирующих слизистую оболочку и репродуктивную иммунологию, но и обеспечивает основу для разработки новых показателей эффективности вакцины для слизистых оболочек.