Белок Выделение из развивающихся эмбриональных Mouse клапанов сердца регионе
23 сентября 2014 г.
Анализ экспрессии белка в клапанах молодых эмбрионов мышей был затруднен из-за ограниченного количества доступной ткани. В данной рукописи представлен протокол получения белка из развивающихся эмбриональных областей клапанов мыши для вестерн-блоттинга.
Общая цель этой процедуры заключается в выделении и извлечении белка из эмбриональных сердечных клапанов. Это достигается путем выделения эмбриона от беременной мыши. На втором этапе сердце рассекается от эмбриона, а затем на заключительном этапе собираются сердечные клапаны.
Ткань лизируют, и полученный образец белка подготавливают для последующего анализа. В конечном счете, западный анализ BLO может быть использован для оценки уровня экспрессии белка. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы вскрытия трудно освоить из-за небольшой компактной формы развивающегося сердца.
В желаемый эмбриональный день развития используйте 70% этанол для стерилизации брюшной полости беременной женщины. Затем поднимите кожу и мышцы нижней части живота вверх и подальше от внутренних органов, а также рассеките нижнюю часть брюшной полости, чтобы обеспечить доступ к маточному рогу. Далее придерживайте шейку матки щипцами и аккуратно разрежьте ее до кончиков.
Затем поднимите маточный рог, разрезав любую соединительную ткань, которая удерживает рог на месте, и завершите удаление, разрезав место соединения маточного рога с УКТ. Поместите рассеченный рог матки в чашку Петри, содержащую холодный 0,1 молярный трис-буфер, и промойте по мере необходимости. Затем разрежьте маточный рог.
Раскройте вдоль, чтобы обнажить эмбриональные мешки. Чтобы обнажить эмбрион, разрежьте эмбриональный мешок на стыке плаценты и эмбриона и разрежьте пупочные сосуды, чтобы освободить эмбрион. Препарированный эмбрион поместите во вторую чашку Петри с холодным 0,1 молярным трис-буфером и верните первую чашку Петри с оставшимися нерасчлененными эмбрионами на лед до следующей эмбриональной диссекции.
После обезглавливания поместите эмбрион на спину и разрежьте грудную стенку вертикально вдоль боковой части грудной клетки рядом с хромотой и горизонтально над диафрагмой. Чтобы визуализировать сердце, откройте грудную стенку. Затем держите щипцы высоко вверх вдоль больших сосудов, поднимите сердце и разрежьте сосуды внизу.
Далее разрежьте над щипцами, чтобы освободить сердце. Если легочные сосуды остаются неразрезанными, удалите легкие вместе с сердцем, прежде чем продолжить на описанных здесь эмбриональных стадиях, легочная артерия слегка помутнена. После выявления артерии разрежьте и удалите ее выше уровня клапана.
Теперь разрежьте чуть ниже легочного клапана, избегая желудочкового миокарда ECD, и удалите избыток трис-буфера подальше от исследуемой области. Перед помещением клапана в эйнорскую трубку, содержащую два микролитра буфера для лизиса, как в легочной артерии, аорта будет казаться слегка непрозрачной. После его выявления разрезают чуть ниже аортального клапана.
Опять же, избегая трабекулированного желудочкового миокарда. Удалите избыток трираствора, а затем перенесите клапан в эйнорскую трубку, содержащую лизис, буфер и ткань легочной артерии. После того, как вся ткань будет собрана, немедленно поместите образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования.
Используйте для извлечения белка, разморозьте собранные ткани на льду, а затем гранулируйте образцы в течение одной минуты при 13, 100 G при четырех градусах Цельсия. Проверьте объем полученного образца и с помощью буфера для лизиса доведите общий объем до 40 микролитров. Затем добавьте пятимиллиметровые шарики из нержавеющей стали, чтобы разрушить и гомогенизировать образцы в лире в течение двух-четырех минут при частоте 50 герц, в соответствии с инструкциями производителя.
После гомогенизации пробирки кратковременно вращают и переносят образцы в новые пробирки, оставляя нерастворимый мусор для дальнейшего экспериментального анализа. Используя эту технологию получения, фосфорилированный smad 1 5 8 может быть обнаружен в областях одиночного аортального клапана из эмбрионов E 13,5. Например, белка, выделенного даже из одной области клапана, достаточно для обнаружения слабой полосы p-smad, интенсивность сигнала которой увеличивается пропорционально количеству областей клапанов, которые объединены.
Важно отметить, что соотношение бета-актина psmad остается четко постоянным при различных размерах образцов из-за низкого уровня доступного белка, один и тот же блот не может быть удален и повторно исследован на общий smad. Тем не менее, отдельный блоттинг, показывающий общий smad one и бета-актин, демонстрирует один и тот же паттерн экспрессии. Эти области клапанов почти полностью лишены контаминирующего миокарда желудочков при использовании данной методики подготовки в сочетании с образцами из правого желудочка, маркера миокарда желудочков, НЧ не обнаруживается в областях аортального клапана, в то время как этот маркер легко обнаруживается в желудочке.
Кроме того, маркер миокарда миозина II V также легко обнаруживается в образце желудочков, но едва обнаруживается в областях аортального клапана, что подчеркивает точность диссекции после этого вскрытия. Другие MES, такие как QPCR или RN AIC, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие последующие гены затрагиваются на различных этапах развития.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол выделения и экстракции белка из эмбриональных сердечных клапанов мышей. Этот метод позволяет решить проблемы анализа экспрессии белков, обусловленные ограниченным количеством доступных тканей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Биология развития
- Сердечно-сосудистые исследования
Теоретические основы
- Анализ экспрессии белков в эмбриональных тканях часто ограничен малым объемом образцов.
- Понимание уровней белков в сердечных клапанах имеет решающее значение для исследований развития.
- Вестерн-блот-анализ является распространенным методом оценки экспрессии белков.
- Диссекция малых тканей, таких как эмбриональные сердца, может быть технически сложной задачей.
Цель исследования
- Представить подробный протокол экстракции белков из сердечных клапанов эмбрионов мышей.
- Обеспечить возможность проведения вестерн-блот-анализа для изучения уровней экспрессии белков.
- Повысить воспроизводимость и точность анализа белков при работе с ограниченным количеством образцов.
Используемые методы
- Выделение эмбрионов из беременных мышей.
- Препарирование сердца эмбриона.
- Сбор сердечных клапанов для экстракции белков.
- Лизис тканей для подготовки образцов белка к анализу.
Основные результаты
- Успешная экстракция белка из сердечных клапанов эмбриона.
- Подготовка образцов, подходящих для вестерн-блот-анализа.
- Демонстрация методов диссекции для эффективного обучения.
- Оценка уровней экспрессии белков в развивающихся тканях сердца.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно изучать экспрессию белков в сердечных клапанах эмбрионов.
- Наглядные пособия необходимы для освоения техники диссекции.
- Этот метод может способствовать развитию исследований в области развития сердца и смежных областях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Выделение белков из ограниченного объема эмбриональной ткани позволяет обнаружить активацию сигнальных путей в моделях раннего развития. Данный подход способствует валидации мишеней, предоставляя полуколичественные данные о фосфорилированных белках из объединенных микродиссекированных участков клапанов. Этот метод устраняет основное препятствие в доклинических исследованиях, когда дефицит образцов затрудняет механистическое снижение рисков при изучении сердечно-сосудистых мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в развитии сердечных клапанов путем обнаружения фосфорилированных сигнальных белков, таких как pSmad1/5/8.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимый рабочий процесс экстракции белков из четырех областей аортального клапана мыши на стадии E13.5, каждая из которых дает ~1 µg белка.
- Прогностическая ценность: способствует отбору приоритетных направлений исследований, позволяя проводить полуколичественную оценку активации сигнальных путей в эмбриональных системах, имеющих значение для изучения заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических образцов для последующего вестерн-блоттинга, что позволяет проводить надежную оценку соединений при фенотипическом скрининге.
- Практическая ценность: Стандартизация протоколов лизиса и гомогенизации с использованием буфера на основе Tris с ингибиторами протеаз и буфера для образцов с SDS для денатурации.
- Масштабируемость: Обеспечение возможности повторного использования платформы на разных этапах развития путем объединения тканей для преодоления ограничений, связанных с низким выходом белка.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь данных об экспрессии белков на этапе поиска с доклинической валидацией за счет использования постоянных соотношений pSmad/β-actin для различных объемов выборок.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность в отношении взаимодействия с мишенью, подтверждая исключение желудочкового миокарда по отсутствию маркеров MYL2V и ANP в областях клапанов.
- Прогностическая достоверность: позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о переходе на следующие этапы разработки, связывая паттерны экспрессии белков с этапами развития с помощью внутреннего контроля.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях до идентификации перспективных соединений-лидеров — обеспечивая получение данных о механизмах функционирования эмбриональных систем, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Биология открытий: Позволяет проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути путем обнаружения фосфорилированных сигнальных белков в ткани клапана.
- Скрининг: Обеспечивает получение готовых к анализу образцов со стандартизированной экстракцией белков, что гарантирует воспроизводимые результаты вестерн-блоттинга для скрининга соединений.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения зависимых переменных по интенсивности хемилюминесцентного сигнала, пропорциональной общему количеству белков, что способствует сравнительному анализу условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность от этапа открытий на эмбрионах до доклинических моделей за счет сохранения специфических паттернов экспрессии путей, которые можно обнаружить на отдельных блотах для общего Smad и β-actin.
- Корпоративное повторное использование: Создает масштабируемую базу для выделения белков в различных исследованиях сердечно-сосудистой системы эмбрионов, сокращая необходимость в повторной разработке протоколов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, обеспечивая возможность детектирования низкоэкспрессированных фосфорилированных белков из микродиссекированных тканей.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет строго определенных объемов лизиса, гомогенизации с использованием микросфер и единообразного приготовления проб для вестерн-блоттинга.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), снижая неопределенность механизмов на ранних этапах оценки сердечно-сосудистых мишеней.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя полуколичественные данные об активации сигнальных путей в областях эмбриональных клапанов.
Особенности реализации
- Требуется опыт микродиссекции структур эмбрионального сердца для выделения областей клапанов без загрязнения миокардом желудочков.
- Необходимы приборы для гомогенизации (лайзер с шариками из нержавеющей стали) и центрифугирование при 13,100 × g для осветления образцов.
- Требуется межгрупповая стандартизация объемов лизирующего буфера (конечный объем 40 µL) и использования ингибиторов протеаз для обеспечения однородности образцов.
- Предусматриваются особенности адаптации при применении протокола к другим эмбриональным тканям или стадиям развития, помимо областей аортального клапана на стадии E13.5.
- Существуют практические ограничения, такие как невозможность количественного определения общего белка с помощью спектрофотометрии из-за низкого выхода, что требует использования полуколичественного анализа методом вестерн-блоттинга.
