Создание Enterobacter Зр. ЕГУ ауксотрофов Использование транспозонный мутагенез

Общей целью данного эксперимента является получение ТРО бактериального штамма дикого типа, которые растут в среде с минимальным количеством солей с добавлением глюкозы. Это достигается путем преобразования зоны транспо в штамм-хозяин дикого типа для получения устойчивой к мицину канны популяции бактерий со случайным транспонированием на вставках. Затем трансформанты проходят скрининг с помощью репликационного покрытия, которое идентифицирует TRO, которые растут на богатой среде, но не могут расти на минимальном количестве солей, в среде с добавлением глюкозы.

Затем геномная ДНК мутанта переваривается, лигируется и трансформируется в кишечную палочку с целью получения плазмиды, содержащей транспозон, фланкированный с каждого конца сегментами прерванного гена. Получены результаты, которые показывают предполагаемую идентичность прерванного гена на основе секвенирования ДНК и базового анализа инструмента поиска локального выравнивания. Транспозон, используемый в этой методике, имеет репликационное происхождение, ген, устойчивый к канамицину, и мозаичные концы.

Для транспонирования связывание с белками. В нем отсутствует ген транспозированного белка, и поэтому мы должны добавить этот ген транспозона к фрагменту транспозонной ДНК, а затем комплекс между транспозной ДНК и белком электропорируется в хозяина. Основными преимуществами электропорации являются исключение необходимости в трансдукции или конъюгации.

Отсутствие транспонирования гена обычно приводит к образованию стабильных вставок, а наличие репликационного происхождения и гена устойчивости к CIN позволяет легко идентифицировать мутировавший ген, который восстанавливается в виде рекомбинантной плазмиды. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии микроорганизмов, такие как идентификация генов, необходимых для биосинтеза аминокислот, нуклеиновых кислот и витаминов. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я искал гены устойчивости к металлам у энтеробактеров вида ЕГУ и решил включить его в лабораторию микробной физиологии, которую я разрабатывал.

ЕГУ готовят разведение от 1 до 20 в свежей среде LB и инкубируют при 30 градусах Цельсия и 120 об/мин до наружного диаметра 600 от 0,4 до 0,6. Когда клетки достигнут нужной плотности, охладите их на льду в течение пяти минут, а затем центрифугируйте при температуре 4 градуса Цельсия и 7000 G в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и используйте равный объем ледяной воды для Resus.

Приостановите центрифугирование клеток при температуре четыре градуса Цельсия и 7 000 G на пять минут. После повторения промывки выбросьте надосадочную жидкость и ледяной водой суспендируйте клетки в объеме, равном объему клеточной гранулы. Далее добавьте 0,5 микролитра зоны транспо на 40 микролитров ячеек.

Затем поместите смесь для зоны транспотерапии клеток в ледяную электропорацию ветеринара и постучите смесью до дна Q Vet, чтобы шокировать клетки при 25 микрофазах, 200 Ом и 2,5 киловольтах. Немедленно добавьте 960 микролитров стерилизованной фильтром среды SOC, перемешанной пипетированием вверх и вниз, перед переносом клеток в стерильную микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия и 120 оборотах в минуту в течение 45-60 минут.

Затем распределите 100 микролитров клеток на агаровой пластине из банки LB перед инкубацией пластины в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия в сетку трансформеров. Приклейте сетку к крышке пустой чашки Петри размером 100 на 15 миллиметров. Нарисуйте линию на дне пластины из агаровой банки LB и с помощью небольшого кусочка ленты закрепите ее на решетчатой крышке так, чтобы сетка была видна через шнек с помощью стерильной зубочистки.

Выберите один трансформатор и найдите его в центре квадрата в сетке, найдите еще один трансформатор в соседнем квадрате и продолжайте до тех пор, пока пластина не заполнится. Затем инкубируйте его в течение ночи при температуре 30 градусов по Цельсию. Это эталонная пластина для каждой пластины, на которую была нанесена сетка.

Сделайте стопку из трех свежих пластин шнека, пронумерованных от одной до трех. Номер один для ЛБ может номер два для М девять может. И номер три для LB может высушить пластины вверх дном в течение ночи при 37 градусах Цельсия перед использованием.

Начертив линию на верхней части каждой пластины, как было показано ранее, используйте 70% этанол для протирания реплики инструмента для нанесения покрытия и поместите на него стерильный квадрат вельтина, прежде чем зажимать квадрат вельтина. Далее совместите линию на эталонной пластине с линией, проведенной на зажиме, и поместите пластину поверх квадрата вельтина. Слегка надавите, чтобы перенести бактерии с тарелки на вельтиновый квадрат.

Затем совместите линию, нарисованную на пластине номер один, с линией на зажиме и поместите ее поверх квадрата вельтина. Слегка надавите, чтобы перенести бактерии с квадрата вельтина на тарелку. Снимите пластину номер один.

Выбросьте бархатный квадрат подростка в стакан с водой и положите чистый стерильный бархатный квадрат на реплику инструмента для нанесения покрытия. Как и раньше, совместите леску на пластине номер один с линией на зажиме и поместите ее поверх нового бархатного квадрата. Слегка надавите, чтобы перенести бактерии с пластины номер один на бархатный квадрат.

Снимите пластину номер один, совместите линию, нарисованную на пластине номер два, с линией на зажиме и поместите ее поверх бархатного квадрата. Слегка надавите, чтобы перенести бактерии с бархатного квадрата на пластину номер два, удалите пластину номер два после повторения процесса для пластины номер три, инкубируйте пластины на ночь при температуре 30 градусов Цельсия. Колонии, которые растут на обеих пластинах LB, но не растут на девяти пластинах M, считаются кладами.

Выберите TRO с пластины номер один и нанесите на свежую тарелку для банок LB. После ночной инкубации выберите три колонии из тарелки для полос и выложите их на свежую тарелку для банок LB на следующий день. Выделите колонии с только что испещренной пластины на решетчатой пластине LB и используйте эту пластину для повторения реплики покрытия, как только что было показано.

Проведите спасение генов. Используйте изолированную колонию мутантов, чтобы вырастить три миллилитра фунта. Можно за ночь выращивать при 30 градусах Цельсия.

Затем используйте коммерчески доступный набор для очистки геномной ДНК для очистки ДНК из одного миллилитра культуры в дозе 0,025 единиц эндонуклеазы BFUC одной рестрикции до 14 микролитров одного микрограмма на микролитр геномной ДНК в реакции объемом 20 микролитров на льду. Затем инкубируйте реакцию при 37 градусах Цельсия в течение 25 минут, прежде чем перенести ее на 80 градусов Цельсия на 20 минут. Чтобы инактивировать фермент, проанализируйте три микролитра частично расщепленной ДНК на геле 0,8% AROS.

Затем добавьте 800 единиц Т-4-лигазы ДНК к 15 микролитрам частично переваренной геномной ДНК в реакции объемом 500 микролитров и инкубируйте реакцию при четырех градусах Цельсия в течение ночи на следующий день. Осаждение лигированной ДНК путем добавления 50 микролитров трех моляров ацетата натрия pH 5,5 и одного миллилитра 95% этанола инкубировать при отрицательных 20 градусах Цельсия в течение 20 минут. Микрофугирование ДНК при четырех градусах Цельсия и 13 500 G в течение 10 минут.

Слейте с места проведения семь 70% этанола для промывки пеллет. Высушите его в центробежном вакуумном концентраторе и используйте 10 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Чтобы ресуспендировать ДНК, используйте четыре микролитра ресуспендированной ДНК для трансформации путем электропорации штамма кишечной палочки, ECD 100 DPIR или ECD 100 DPIR, один 16 инокулируют пять миллилитров LB в среду с одной колонией.

Выращивайте его при 37 градусах Цельсия и 120 оборотах в минуту за ночь. На следующий день после очистки ДНК от всей культуры, используйте Joe one, чтобы переварить 14 микролитров плазмиды. Проанализируйте 10 микролитров непереваренной и переваренной плазмиды на 0,8% геле агарро.

После секвенирования плазмиды осуществляется поиск последовательности пяти простых GA, G-A-C-A-G трех простых, которые являются последними семью парами оснований транспонирования на и за которыми последует последовательность для прерванного гена. Используйте бласт для определения возможной функции прерванного гена. В результате успешной электропорации было получено несколько тысяч трансформаторов, каждый из которых имел хотя бы одну вставку на этой фигуре.

Черными квадратами показаны две колонии, которые выросли на пластине LB can, но не на минимальной средней пластине M nine. Эти TRO, вероятно, содержали прерывания в генах, участвующих в синтезе аминокислоты, нуклеиновой кислоты или витамина, которые все находятся в lb, но не в M 9, минимальной среде. В остальных 86 колониях не было прерывания гена, необходимого для роста на М9.

В минимальной среде, как показано здесь, частично переваренная геномная ДНК из изолированного TRO имеет размер от более чем 10 килооснований до менее 0,5 килооснований. Спасенная плазмида состоит из транспозона с двумя килооснованиями и фланкирующей ДНК хозяина. На этом рисунке показан результат взрыва плазмиды, которая была выделена из тро.

Прерванная последовательность аналогична гену энтеробактер клой для мутазы ate, которая участвует в биосинтезе L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана из-за нескольких этапов роста в течение ночи. Эта техника может быть выполнена за 10 или 11 дней при правильном выполнении. При копировании пла важно помнить, что пластины нельзя размазывать, и вы можете предотвратить это, используя сухие пластины и не перемещая пластины после того, как они были помещены на квадрат вельтина.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как эксперименты по клонированию или комплементации, чтобы проверить функцию идентифицированного гена. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генерировать TRO с помощью мутагенеза транспозонов и как предварительно идентифицировать мутировавшие гены.