С 2DE-гель пятна с белком Функция: Урок, извлеченный из HS1 в хронический лимфолейкоз

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании комбинированного протеомного подхода для определения потенциальных прогностических маркеров и/или терапевтических мишеней при заболеваниях человека. Это достигается путем выделения первичных лейкозных клеток из периферической крови пациента, несущих хороший или плохой прогноз, и экспрессии поверхностных маркеров CD 19 и CD 5 для использования в протеомном анализе в качестве второго этапа. Лизаты лейкозных клеток разрешаются с помощью двумерного электрофореза или двух де, а сравнение протеомных карт позволяет идентифицировать пятна, дифференциально экспрессирующиеся у пациентов с хорошим и плохим прогнозом, которые впоследствии могут быть идентифицированы с помощью масс-спектрометрии или мс.

Затем можно использовать различные анализы для того, чтобы подтвердить и проанализировать роль идентифицированных белков в естественном течении заболевания. Результаты показывают, что различный статус фосфорилирования ГС, обнаруженный двумя дегелями, коррелирует с клиническим исходом пациентов. Применение этого метода распространяется на терапию хронического лимфоцитарного лейкоза, потому что он может помочь идентифицировать белок, участвующий в прогрессировании заболевания, который может быть использован в качестве прогностического маркера и/или терапевтической мишени, демонстрируя эту процедуру вместе со мной.

Памела побежала к технику в лабораторию и постдоку из внешней лаборатории Перед началом этой процедуры соберите периферическую кровь в вакутайнерные пробирки для сбора крови с гепарином натрия. Перелейте кровь в пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте коктейль для обогащения В-клеток человека в количестве 50 микролитров на миллилитр цельной крови. Затем хорошо перемешать и выдерживать 20 минут при комнатной температуре.

После инкубации разбавьте образец равным объемом PBS плюс 2% FBS, аккуратно перемешайте и осторожно наложите кровь на крик мухи, стараясь не повредить границу раздела. Центрифугируйте образец при 400-кратном перегрузке при комнатной температуре в течение 20 минут без перерыва. Когда закончите, осторожно отсасывайте интерфейс для восстановления клеток и поместите их в новую пробирку.

Промойте клетки один раз PBS после центрифугирования и удаления надосадочной жидкости. Ресус. Суспендируйте гранулу в оставшейся надосадочной жидкости, вручную перелистывая пробирку вперед и назад после разведения. При использовании полной среды RPMI подсчитайте ячейки с помощью метода исключения синего Триана.

Далее добавьте следующие антитела к 100 микролитрам очищенной клеточной суспензии в пробирке для факса. Инкубируйте образец в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. После промывки образца четырьмя миллилитрами PBS проверьте чистоту методом проточной цитометрии.

Проверьте процент клеток хронического лимфоцитарного лейкоза или ХЛЛ, которые Coex экспрессируют CD 19 и CD 5 на своей поверхности. Убедитесь, что препараты практически лишены NK-т-лимфоцитов и моноцитов, проверив процентное содержание третьего CD, CD 14 и CD 1656 на графике, которое должно быть близко к нулю на этом этапе. Солюбилизируйте гранулы клеток ХЛЛ с конечным объемом 380 микролитров двумерного буфера для электрофореза.

Нанесите один миллиграмм образцов белка на 18 полосок IPG для выполнения изоэлектрофокусировки. После прогона уравновесьте полоски в двух миллилитрах уравновешивающего буфера, дополненного 2% свежего DTT в течение 15 минут при комнатной температуре. После сброса раствора добавьте два миллилитра уравновешивающего буфера, дополненного 2,5%I ото-ацетамидом.

Затем инкубируйте образец в течение 15 минут при комнатной температуре на качающейся платформе. После этого высушите полоски на бумаге, не прикасаясь к гелю, чтобы удалить излишки раствора. После высыхания загрузите каждую полоску поверх геля для страницы SDS с градиентом от 9 до 16%.

Добавьте небольшой объем буфера для электрофореза SDS поверх геля, чтобы облегчить нагрузку на полоску. Затем запечатайте гель, добавив примерно пять миллилитров 0,8%-ного раствора агара, чтобы предотвратить всплытие полоски. После того, как блок электрофореза будет собран, заполните его буфером для электрофореза SDS.

Затем выполните прогон со скоростью 60 миллиампер на гель в течение четырех часов, четырех градусов Цельсия, или с помощью системы охлаждения. После извлечения геля из электрофоретического блока поместите его в соответствующую коробку для окрашивания. Приготовьте около 200 миллилитров каждого раствора.

Осторожно добавьте каждый раствор в коробку для окрашивания, содержащую гель. Выполняйте все инкубации на качающейся платформе. После окрашивания удалите стоп-раствор и оставьте гель в растворе 1%-ной уксусной кислоты до приобретения.

Для анализа миграции резус суспендирует ранее очищенные клетки. В полной RPMI подготовьте нижнюю трансвелловую камеру, добавив 600 микролитров полной RPMI с определенными раздражителями или без них. Чтобы измерить индуцированную и спонтанную миграцию соответственно, поместите верхнюю камеру сверху и дайте системе уравновеситься в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе.

Когда закончите, высадите от 10 до шести клеток по 200 микролитров в верхней камере и инкубируйте планшет в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе. После инкубации снимите верхнюю камеру и соберите среду в нижнюю камеру. Затем один раз промойте нижнюю камеру одним миллилитром PBS.

После сбора PBS в пробирку центрифугируйте образец в течение пяти минут при 300-кратном G после удаления надосадочной жидкости. Ресуспендировать образец в 500 микролитрах PBS с помощью проточной цитометрии. Подсчитайте количество перенесенных ячеек после одной минуты сбора.

Проверьте количество ячеек на двумерной точечной диаграмме с учетом боковых разброса ячеек и количества событий, визуализированных за одну минуту, которое является числом, используемым для расчета. Изолированные образцы первичных лейкозных клеток пациентов с ХЛЛ были сгруппированы в две основные подгруппы на основе клинических особенностей каждого пациента и проанализированы по двум массам ДЭ и РС в пределах определенного толерантного варианта массы. Они были присвоены пептидным последовательностям в базе данных, а затем собраны в белок, который считается идентифицированным, если он проходит определенную оценку вероятности.

С помощью этого анализа среди этих белков были идентифицированы белки, в основном участвующие в активности цитоскелета и метаболических процессах. Гемопоэтическая линия, специфический для клетки белок или hs. У одного, у которого дифференциальное фосфорилирование было сильно связано с клиническим течением заболевания, было дифференциально экспрессировано.

В частности, пациенты с одним пятном имеют плохой клинический исход, в то время как пациенты с двумя пятнами имеют хороший прогноз. Установлено, что клетки ХЛЛ, несущие ГС по одному пятну, имеют нарушенную цитоскелетную активность с точки зрения миграции, адгезии и полимеризации актина по сравнению с гипофосфорилированными ГС. Один, два точечных образца. Тем самым объясняется иное клиническое поведение.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать протеомные средства для выявления биологических кандидатов, участвующих в прогрессировании заболевания, которые могут быть использованы в качестве прогностических маркеров и/или терапевтических мишеней.