Метод скрининга и проверка мутаций устойчивости против ингибиторов киназ

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении и валидации мутаций, устойчивых к лекарствам. Это достигается путем создания библиотеки случайных мутаций целевого онкогена. Вторым этапом является проведение скрининга in vitro на появление устойчивых клонов.

Третьим этапом процедуры является секвенирование устойчивых клонов для выявления резистентных мутаций. Последним шагом является валидация резистентных мутаций путем воссоздания мутаций с помощью сайт-направленного мутагенеза с последующим анализом in vitro и in vivo. В конечном счете, клинически значимые лекарственно-устойчивые мутации могут быть идентифицированы в отношении данной пары мишеней для лекарств.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ENU или методы на основе ПЦР, заключается в том, что он непредвзятый и, в отличие от METAGENE ssis на основе ПЦР, этот метод не ограничен размером онкогена или содержанием GC в любом гене. Как правило, новички в этой технике испытывают трудности из-за недостатка знаний в молекулярной и клеточной биологии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение.

Поскольку неогенез и этапы скрининга трудно изучить. Это связано с тем, что многим людям не хватает опыта в производстве вирусов, в клеточных культурах и полуклеточных средах. Эта процедура начинается с трансформации клеток XL one red e coli с плазмидой, несущей JAK two V 617 f онкогенную изоформу JAK two XL one red e coli клетки с дефектами в механизмах репарации ДНК, что позволяет им включать случайные мутации во время репликации.

Смешайте от 50 до 100 нанограммов плазмидной ДНК со 100 микролитрами компетентных клеток в предварительно охлажденной полипропиленовой пробирке. Не используйте более 100 нанограммов ДНК, так как это снижает эффективность трансформации. Инкубируйте на льду в течение 30 минут, осторожно поворачивая каждые пять минут для хорошего покрытия библиотеки.

Используйте от четырех до шести пробирок с компетентными клетками. Погрузите полипропиленовые трубки в водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия для теплового шока в течение 45 секунд, а затем выиграйте на льду в течение двух минут. Далее добавьте по одному миллилитру среды SOC в каждую пробирку.

Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью от 225 до 250 об/мин в течение 90 минут. Пластинчатые ячейки на четырех 10-сантиметровых шнековых пластинах LB, содержащих 100 микрограммов на миллилитр ампициллина. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16–24 часов.

Как только колонии станут видимыми, соберите их, соскребая пластины стерильным скребком для тарелок. Объедините ячейки с каждой тарелки. Затем плазмидную ДНК выделяют с помощью коммерческого набора для экстракции плазмид и оценивают гетерогенность мутаций в библиотеке путем секвенирования за один день до трансфекционной пластины, четыре раза по 10 до шестой HEK 2 93 Т-клеток, на 100-миллиметровых чашках в DM EM, содержащем 10% FCS, пенициллин, стрептомицин и два миллимолярных L-глутамина.

На следующий день приготовьте реактивы для трансфекции для каждой 100-миллиметровой посуды. Смешайте пять микрограммов плазмидной библиотеки, пять микрограммов ретровирусной плазмиды и 40 микролитров гена FU до общего объема 400 микролитров с использованием бессывороточных сред DM E EM. Инкубируйте смесь ДНК и липидов в течение 20 минут при комнатной температуре.

Затем замените среду HEK 2 93 Т-клеток свежей средой и добавьте липидный комплекс ДНК по каплям поверх клеток. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести часов. Через шесть часов замените трансфекционную среду свежей средой и инкубируйте планшеты в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия на каждую выработку вируса.

После 48 часов инкубации соберите вирусные надосадочные жидкости, отфильтрованные через акро-дисковый фильтр 0,45 мкм, чтобы начать процедуру скрининга и идентификации лекарственно-устойчивых мутантов JAK два мутанта V 607 F трансдуцируют три клетки BAF с ретровирусными надосадочными зонтами. Смешайте 100 миллионов BAF трех клеток со 100 миллилитрами супернатанта вируса до общего объема 300 миллилитров с использованием среды RPMI, содержащей 10% сыворотки и полимозговой жидкости. Распределите эту смесь клеток и вирусов на несколько шестилуночных планшетов, заполнив каждую лунку на четыре-пять миллилитров.

Центрифугируйте планшеты при давлении 1,250 GS в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия. После центрифугирования инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов на следующий день, объедините трансдуцированные клетки для каждой концентрации препарата. Смешайте 10 миллилитров клеток с руксолитинибом в 50 миллилитровой тубе.

Концентрации руксолитиниба, протестированные в этом примере, составляют 1, 5, 2, 0,5 и 10 микромоляров. Доведите объем до 40 миллилитров с помощью RPMI, содержащей 20% сыворотки. Добавьте в ячейки 10 миллилитров 1,2%-ного шнека и тщательно перемешайте в шести луночных тарелках.

Дозирование по четыре миллилитра на лунку. Выдерживайте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух недель. Как только резистентные колонии станут заметны, используйте наконечники для пипетки объемом 0,2 миллилитра, чтобы выбрать колонии и субкультивировать их по отдельности.

В 24 луночных планшетах в течение трех-четырех дней собирают устойчивые к BAF три ячейки путем центрифугирования при 450 GS в течение пяти минут при комнатной температуре. После выделения геномной ДНК с помощью коммерческого набора для экстракции геномной ДНК амплифицируйте две ДНК JAK по всей длине из геномной ДНК методом ПЦР. Затем продукты ПЦР разделяют с помощью гель-электрофореза Agar Rose и полосы ДНК 3,4 KILOBASE.

Представляя собой JAK, каркас с двойным покрытием изолирован с помощью коммерческого набора для экстракции геля. Наконец, секвенируйте полноразмерную CDNA с использованием восьми внутренних праймеров, охватывающих кодирующую последовательность, и проанализируйте последовательности с помощью коммерческого программного обеспечения для валидации мутаций, устойчивых к лекарствам. Отобранные варианты in vitro генерируются путем сайт-направленного мутагенеза последовательности JAK two V 617 F и повторно вводятся в три клетки BAF.

Добавьте 50 микролитров среды, содержащей различные концентрации руксолитиниба, в лунки поперек планшета отдельно, планшет 10 к четвертому из BAF три JAK два V 617 F элементы в каждую лунку 96 луночного планшета инкубируйте планшеты при 37 градусах Цельсия в течение 60 часов Чтобы оценить жизнеспособность клеток, добавьте 10 микролитров WST одного реагента в каждую лунку и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение двух-четырех часов. Запишите поглощение на уровне 450 с помощью считывателя пластин. Выполните все анализы в трех экземплярах и нанесите график средней абсорбции в зависимости от концентраций руксолитиниба.

Выполнение сигмоидальной кривой наилучшего аппроксимации с использованием оценки алгоритма нелинейной аппроксимации. Концентрацию препарата, приводящую к 50% жизнеспособности клеток в качестве клеточного IC 50, в последующем in vivo валидацию резистентных мутаций проводят, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Поскольку резистентные клеточные клоны, полученные в результате случайного мутагенеза, могут нести более одной мутации, эти мутации должны быть проверены изолированно с помощью анализов in vitro и in vivo.

В анализе in vitro выбранные варианты были получены путем сайт-направленного мутагенеза последовательности JAK two V 607 F и повторно введены в три клетки BAF, которые затем были измерены на способность клеток к пролиферации при различных дозах руксолитиниба для оценки значений IC 50. Кроме того, иммуноблоттинг на фосфотирозин или фосфо STAT 5 проводили на белковых лизатах трех клеток BF, которые инкубировали с возрастающими дозами руксолитиниба для исключения любой нецелевой опосредованной резистентности. Таким образом, подтверждено, что мутанты, демонстрирующие повышенные значения IC 50 и стойкое аутофосфорилирование при более высоких концентрациях руксолитиниба, являются лекарственно-устойчивыми вариантами для валидации резистентности in vivo.

BF три клетки, сконструированные для экспрессии JAK, двух V, шести, 17 вариантов F и люциферазы вишни, были введены мышам, которым впоследствии вводили руксолитиниб в течение двух недель. Через две недели. У мышей проводили визуализацию на биолюминесценцию, катализируемую люциферазой, химеризм BAF three в костном мозге и периферический кровоток оценивали путем измерения флуоресценции положительных клеток вишни.

Результаты показывают, что мыши, экспрессирующие JAK 2 V 607 F, были к руксолитинибу, в то время как резистентные варианты демонстрировали прогрессирующее увеличение биолюминесценции в течение периода лечения. После освоения случайный неогенез может быть выполнен за четыре-пять дней, если он выполнен правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разработать рандомизированную плазмиду, библиотеку ДНК для скрининга in vitro против любой целевой пары лекарств.

Не забывайте, что работа с ретровирусами может быть крайне опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.