Экспериментальные и визуализации Методы для изучения сгустка фибрина структур в норме и болезненные состояния,
1 апреля 2015 г.
В этой рукописи представлены экспериментальные методы, включая подготовку крови, конфокальную микроскопию и анализ скорости лизиса, для изучения морфологических различий между нормальными и аномальными структурами сгустков из-за болезненных состояний.
Общая цель этой процедуры заключается в изучении морфологических различий в аномальных структурах тромбов, которые возникают при диабете и серповидноклеточной анемии, заболеваниях при моделировании диабетических тромбов. Это достигается путем визуализации гликированных структур сгустков с помощью конфокальной микроскопии образцов крови пациентов с серповидноклеточной анемией. Сгустки фибрина, содержащие эритроциты, визуализируются в режиме реального времени.
Затем может быть проведен микроскопический анализ для оценки скорости фибринолиза на нормальных и гликированных структурах сгустка. В конечном счете, этот анализ в режиме реального времени может быть использован для оценки морфологических различий, которые возникают в аномальных структурах сгустков в ответ на болезненные состояния, в которых они возникают. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тромбоза и гемостаза, например, как отличаются структуры фибринового сгустка у пациентов с диабетом или серповидноклеточной анемией.
Чтобы оценить смоделированные диабетические тромбы с помощью конфокальной микроскопии, сначала разморозьте человеческий фибриноген и 10% флуоресцентно меченный человеческий фибриноген конъюгат при температуре 37 градусов Цельсия при смешивании растворов подогретого с человеческим фибриногеном и фибриногеном в растворе глюкозы трикс натрия хлорида и инкубируйте раствор, защищенный от света, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. Ближе к концу инкубации с помощью клея на нежидкой основе наклейте тонкий клей с двух сторон предметного стекла микроскопа, чтобы получилась камера, затем смешайте раствор фибриногена с фактором комнатной температуры 13 и тромбином до конечного объема 50 микролитров и немедленно перенесите 30 микролитров раствора фибрина в камеру предметного стекла микроскопа. Теперь поместите поверх клея стеклянную крышку размером 22 на 22 миллиметра с острием толщиной 15 миллиметров и заклейте открытые стороны камеры прозрачным клеем, следя за тем, чтобы клей не взаимодействовал со сгустком.
Дайте фибриновым сгусткам полимеризоваться при температуре от 21 до 23 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем получите конфокальные микроскопические изображения сгустков с помощью объектива с 40-кратным увеличением и аргонового лазера 488 нанометров, чтобы оценить тромбы у пациентов с серповидноклеточной анемией. Сначала разведите образец эритроцитов в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр в питательной среде для свободных клеток сыворотки крови и смешайте клетки с пятью микролитрами соответствующего раствора для мечения клеток с помощью щадящего пипетирования.
Через 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия промойте клетки три раза в среде с температурой 37 градусов Цельсия, пока клетки находятся в центрифуге, смешайте свежеприготовленный раствор фибриногена фактора 13 и тромбина, как показано выше. Затем перенесите 10 микролитров меченых эритроцитов в раствор фибрина и сразу же дозируйте 30 микролитров клеточного раствора в адгезивную камеру. На предметном стекле стеклянного микроскопа дайте фибрину полимеризоваться при температуре от 21 до 23 градусов Цельсия через два часа, получите конфокальные изображения сгустков с помощью возбуждающих лазеров с длинами волн 488 нанометров и 633 нанометра для возбуждения флуоресцентно меченых фибрина и эритроцитов соответственно.
Чтобы оценить скорость фибринолиза и структуры гликированных сгустков, сначала приготовьте гликированные сгустки, как это было показано на этот раз. Однако после дозирования раствора фибринового сгустка в адгезивную камеру не запечатывайте торцы камеры. Вместо этого дайте сгусткам полимеризоваться при температуре от 21 до 23 градусов Цельсия в герметичном корпусе, содержащем 250 миллилитров воды, чтобы предотвратить обезвоживание.
Через полтора часа получите изображения сгустков с помощью конфокальной микроскопии, как показано на рисунке. Затем нанесите пипеткой 25 микролитров плазмина в открытый конец камеры и дайте плазмину диспергироваться по всему сгустку за счет капиллярного действия. Наконец, откройте функции временных рядов программного обеспечения конфокального микроскопа, нажмите «Режим сбора» и выберите временные ряды.
Затем выберите количество циклов и временной интервал записи, чтобы сделать видеосъемку в режиме реального времени лизиса плазминового сгустка Анализ нормальных и гликированных сгустков показывает, что гликированные сгустки более плотные с меньшими порами, чем нормальные сгустки, как с добавлением фактора 13, так и без него во время полимеризации сгустка. Действительно, в гликированных сгустках UN наблюдается более низкая концентрация фибрина, что создает менее плотную структуру, чем та, которая наблюдается в гликированных сгустках, которые содержат более высокую концентрацию фибрина. Фибриновые сгустки у пациентов с серповидноклеточной анемией содержат эритроциты и демонстрируют более плотную структуру, чем у здоровых фибриновых сгустков, из-за повышенной концентрации фибриногена у этих людей.
Кроме того, естественная тенденция эритроцитов пациентов с серповидноклеточной анемией образовывать агрегаты и полы, скопления эритроцитов, которые вплетаются в фибриновую сеть, что приводит к образованию аберрантных структур сгустков, которые заметно отличаются по морфологии от тех, которые наблюдаются у здоровых пациентов. Наконец, анализ скорости фибринолиза нормальных и гликированных тромбов демонстрирует значительное снижение способности смоделированных диабетических тромбов к образованию фибрина в отсутствие достаточного количества плазмина. Это исследование поможет проложить путь исследователям в области тромбоза и гемостаза, особенно для пациентов, у которых развиваются коморбидные патологии в результате серповидноклеточной анемии и диабета.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются морфологические различия в структурах аномальных тромбов, связанных с сахарным диабетом и серповидноклеточной анемией. С помощью конфокальной микроскопии целью работы является анализ гликированных структур тромбов и скорости их фибринолиза.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тромбоз
- Гемостаз
- Микроскопия
Теоретическая часть
- Аномальные структуры тромбов могут приводить к тяжелым осложнениям для здоровья.
- Известно, что сахарный диабет и серповидноклеточная анемия влияют на морфологию тромбов.
- Понимание этих различий имеет решающее значение для разработки таргетной терапии.
- Методы визуализации в реальном времени позволяют получить представление о поведении тромбов.
Цель исследования
- Изучить морфологические различия в сгустках крови пациентов с сахарным диабетом и серповидноклеточной анемией.
- Оценить влияние гликированных структур на скорость фибринолиза.
- Решить ключевые вопросы в области исследований тромбоза и гемостаза.
Используемые методы
- Подготовка образцов крови пациентов с серповидноклеточной анемией.
- Конфокальная микроскопия для визуализации структур гликированных тромбов.
- Анализ фибриновых тромбов, содержащих эритроциты, в режиме реального времени.
- Оценка скорости фибринолиза нормальных и гликированных тромбов.
Основные результаты
- Выявлены отчетливые морфологические различия в структуре сгустков.
- Продемонстрированы различия в скорости фибринолиза между нормальными и патологическими сгустками.
- Получены новые данные о влиянии патологических состояний на поведение сгустков.
- Внесен вклад в понимание механизмов тромбоза у пациентов с сахарным диабетом и серповидноклеточной анемией.
Выводы
- Конфокальная микроскопия в режиме реального времени эффективна для изучения морфологии тромба.
- Структуры аномальных тромбов значительно различаются при патологических состояниях.
- Полученные результаты могут лечь в основу будущих терапевтических стратегий лечения заболеваний, связанных с тромбообразованием.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Понимание морфологических и функциональных различий в структуре фибриновых сгустков при таких заболеваниях, как сахарный диабет и серповидноклеточная анемия, дает важную информацию для валидации мишеней в исследованиях тромбоза. Данный подход позволяет снизить механистические риски путем установления связи между аберрантными фенотипами сгустков и патофизиологическими механизмами, что повышает прогностическую достоверность при выборе доклинических моделей. Эта методология способствует идентификации трансляционных биомаркеров путем корреляции структурных особенностей сгустка со скоростью лизиса, что позволяет принимать обоснованные решения о продвижении препаратов в программах разработки лекарств, направленных на регуляцию гемостаза.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации того, как вызванное болезнью гликирование изменяет архитектуру и пористость сети фибрина.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого сравнения структур нормального и патологического сгустка в контролируемых экспериментальных условиях.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени путем идентификации структурных биомаркеров, связанных с нарушением фибринолиза при различных заболеваниях.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка стандартизированных моделей сгустков фибрина с гликированием или без него, а также с включением эритроцитов или без них, для воспроизводимого скрининга соединений.
- Количественные данные: Возможность измерения скорости лизиса в реальном времени посредством плазмин-индуцированной деградации сгустка, что обеспечивает получение кинетических показателей для оценки эффективности соединений.
- Масштабируемость: Адаптация к многолуночным форматам за счет иммобилизации в камерах, что позволяет проводить средний по пропускной способности анализ агентов, модулирующих фибрин.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирование коморбидных тромботических патологий путем симуляции диабетических тромбов и анализа образцов, полученных от пациентов с серповидноклеточной анемией, что повышает прогностическую ценность доклинических исследований.
- Механистическая преемственность: Обеспечение связи между этапами поиска и доклиническими исследованиями путем сопоставления структурных аномалий тромба с функциональным дефицитом лизиса, что позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go).
- Соответствие биомаркерам: Корреляция концентрации фибрина, размера пор и интеграции эритроцитов с нарушением лизиса, что способствует валидации трансляционных биомаркеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, предоставляя структурные и функциональные фенотипы тромбов, которые позволяют осуществлять подбор и оптимизацию соединений на основе механизмов их действия.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о том, как сахарный диабет и серповидноклеточная анемия изменяют ультраструктуру и стабильность фибринового сгустка.
- Скрининг: предоставляет готовые для анализа модели сгустков со стандартизированными протоколами полимеризации и визуализации для оценки соединений, воздействующих на фибрин или модулирующих его.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения скорости лизиса и морфологические показатели (плотность, размер пор, клеточная интеграция) для проведения сравнительного анализа при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают структурные фенотипы сгустка с функциональными исходами при тромбозе, способствуя доклинической валидации механизмов, значимых для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации и анализа с целью изучения динамики сгустков при различных моделях заболеваний и терапевтических вмешательствах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет прямой визуализации вызванных заболеванием изменений в архитектуре фибринового сгустка и их корреляции с функциональным дефицитом лизиса.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированной подготовки сгустка, параметров конфокальной визуализации и отслеживания лизиса в режиме реального времени в разных экспериментальных повторностях.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах выявлять соединения, которые нормализуют патологическую структуру сгустка или восстанавливают фибринолиз, что снижает риск неудач на поздних стадиях разработки.
- Влияние на портфель: Помогает в приоритизации мишеней гемостаза с учетом рисков, предоставляя структурные и функциональные данные о фенотипах сгустков, измененных при заболевании.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией, флуоресцентным мечением и биохимией фибрина для точного приготовления сгустков и их визуализации.
- Зависимость от наличия аргоновых и гелий-неоновых лазеров для двухканального возбуждения меченого фибрина и эритроцитов.
- Необходимость использования контролируемых климатических камер для предотвращения дегидратации во время полимеризации и анализов лизиса в режиме реального времени.
- Требуется оптимизация концентрации плазмина и динамики капиллярного потока для обеспечения единообразного начала лизиса во всех образцах сгустков.
- Ограничение, связанное с необходимостью использования свежих образцов человеческой крови или очищенных компонентов, что может затруднить масштабирование в условиях высокопроизводительного скрининга.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Confocal Microscopy Evaluation of Glycated Clot Structures
2:50
Confocal Microscopy Evaluation of Fibrin Clots Containing Red Blood Cells (RBCs) from Sickle Cell Patients
4:06
Confocal Microscopy Evaluation of Fibrinolysis Rates in Glycated Clot Structures
5:19
Results: Confocal Microscopy Analysis of Glycated Fibrin Clot Structures
6:38
Conclusion
