Характеризуя Состав молекулярных моторов на перемещение аксонов Грузы Использование "Грузовой Mapping" Анализ

Общая цель картирования грузов состоит в том, чтобы определить относительное количество и тип молекулярных моторных белков, которые связываются с везикулярными грузами и перемещают их, а также соотнести этот состав моторов с направленностью движения живого груза. Это достигается путем выращивания первичных нейронов гиппокампа мыши в микрофлюидных устройствах таким образом, чтобы аксоны росли относительно прямыми, а также путем регистрации живого внутриклеточного движения флуоресцентно меченных белков груза в аксонах временно трансфицированных нейронов. Второй шаг заключается в фиксации нейронов в ходе визуализации живого груза и последующем окрашивании аксонов антителами против молекулярных моторных белков, таких как кинезин и дины, с последующей иммунофлуоресцентной микроскопией.

Затем изображения неподвижного груза и мотора выравниваются с графиками движения груза во времени, также называемыми крафтами, чтобы коррелировать движение груза в реальном времени с окрашенными связанными моторами, определенными иммунофлуоресцентным окрашиванием. Заключительным этапом является определение субпиксельных положений грузовых и моторных белков с помощью специально разработанного программного пакета MATLAB, называемого моторной колокализацией. Это программное обеспечение предоставляет точные координаты XY для каждого грузового и моторного местоположения, а также относительную величину интенсивности флуоресценции, связанной с грузами и двигателями.

В конечном счете, корреляция флуоресцентной микроскопии действующих и неподвижных грузов и двигателей на уровне субпиксельного разрешения дает информацию о типах двигателей, связанных с конкретными грузами, для которых известна направленность движения. Таким образом, этот метод дает представление о механизме переноса экзонов. Он может быть применен к другим исследованиям, коррелирующим жизненную микроскопию с иммунофлуоресцентным окрашиванием, таким как ассоциация белков с микротрубками во время динамики микротруб или рекрутирование белков во время эндоцитоза.

Визуальная демонстрация этого метода поможет выполнить этапы фиксации и анализа изображения, которые в противном случае было бы трудно освоить, поскольку они требуют специализированной настройки. Первичные нейроны гиппокампа мыши для этой процедуры подготавливаются в соответствии с протоколом и ресуспендируются при росте нейробазального яйца. Среда для пластинирования нейронов в микрофлюидном устройстве.

Удалите среду из микрофлюидного резервуара по одному и одному грунту. Нанесите 20 микролитров клеток на один микрофлюидный резервуар и дайте им пройти. Поместите устройство в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на 20 минут.

Загляните под микроскоп, чтобы убедиться, что клетки прилипли к покрытому стеклу. Добавьте нейробазальный, питательную среду, чтобы долить все резервуары. Верните устройство с ячейками в инкубатор к девятому дню.

В культуре нейроны протягивают аксоны по микроканалам и готовы к трансфекции для экспрессии флуоресцентных белков. Живая визуализация трансфицированных первичных нейронов гиппокампа мыши выполняется на микроскопе с инвертированным эпифлуоресцентным светом, оснащенном инкубатором с температурой 37 градусов Цельсия и камерой контроля CO2. Чтобы начать эту процедуру, выберите объектив 100 x масляный.

Нанесите масло на объектив и закрепите крышку с нейронами гиппокампа, выращенными в микрофлюидном устройстве, на предметный столик микроскопа. Чтобы избежать гибели нейронов, необходимо оперативно поддерживать образцы под микроскопом не дольше одного часа. Найдите аксоны трансфицированных клеток, которые проходят по каналам микрофлюидной камеры.

Запишите количество каналов, в которых был обнаружен трансфицированный аксон. Подсчитывайте количество каналов с помощью ручного счетчика для оптимальной записи движений в реальном времени и последующего анализа колокализации. Выбирайте аксоны, которые прорастают относительно плоскими через каналы, чтобы можно было сфокусировать изображение большинства везикул.

Для облегчения последующего совмещения неподвижных изображений с траекториями движения на трансплантате. Выровняйте правый край микроканалов по полю зрения во время визуализации. Для того, чтобы успешно зафиксировать клетки во время визуализации в реальном времени, процедуру лучше всего выполнять с двумя людьми, один из которых должен добавить фиксатор, а другой — настроить фокус.

Также важно, чтобы все реагенты были наготове и находились в пределах досягаемости. С помощью пластиковой переводной пипетки объемом один миллилитр. Удалите большую часть среды из второго и второго резервуаров Prime Start: визуализация движения груза в реальном времени с учетом динамики транспортировки анализируемого груза.

После того, как будет собрано достаточное количество данных о движении в реальном времени, пусть один человек наполнит резервуары два и два предтеплым фиксатором. Избегайте прикосновения к микрофлюидному устройству, так как это нарушит фокусировку визуализации в реальном времени. Попросите другого человека отрегулировать фокус во время добавления фиксатора.

Таким же образом заполнение резервуаров по одному и одному прайму с фиксирующей фиксацией успешно, когда наблюдается немедленное прекращение движения. Затем фиксированные нейроны окрашивают антителами против эндогенных моторных белков и визуализируют, как описано в тексте протокола. Для начала картографирования груза сгенерируйте хромограф движения груза с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Плагин Image J, разработанный компанией Rich Dorf Insights, рекомендуется для генерации Kraft с использованием коммерчески доступного графического программного обеспечения: вручную выровнять иммунофлуоресцентное изображение груза по графику движения груза CHM, наложить точки груза на положение траекторий на графике CHM в точке фиксации таким образом, чтобы каждая точка груза соответствовала определенной траектории на графике CHM. Для достижения наилучших результатов выравнивания используйте Z-образный срез, который находится в наилучшем фокусе для нанесенного на карту груза. Для каждого изображения в стеке Z можно использовать несколько Z-срезов.

Определите координаты XY и амплитуды интенсивности для каждой флуоресцентной точки с помощью установленного алгоритма, чтобы подогнать 2D-гауссианы к функции распределения точек, представляющей точечные источники в каждом из трех каналов. Для получения координат XY был разработан специально созданный программный пакет MATLAB под названием «Моторная колокализация», который включает в себя алгоритм гауссовской подгонки, разработанный Якимой Доной и его коллегами для каждой из отдельных точек груза, которые были нанесены на мобильные или стационарные траектории. На графике Кога выберите координаты XY и амплитуды интенсивности по результатам программы колокализации мотора.

Используйте несколько изображений Zack, чтобы нанести на карту больше грузов, которые находятся в разных фокальных плоскостях. Сравните отдельные координаты XY для нанесенного на карту груза с координатами, полученными для каждого из моторных каналов в соответствующем Z-срезе. Определите и выберите координаты двигателя XY, которые находятся в радиусе 300 нанометров от груза для грузов и двигателей, которые подали сигнал в одной фокальной плоскости.

Используйте пакет программного обеспечения для колокализации двигателей для определения точек, расположенных в радиусе 300 нанометров. Картирование грузов было использовано для корреляции транспортировки везикул, несущих нормальный прионный белок, помеченный желтым флуоресцентным белком или Y-F-P-P-R-P-C, с относительными количествами кинезина и дин-моторов в аксонах. На этом графике показано движение везикул F-P-P-R-C, а пунктирной линией указано время фиксации во время визуализации в реальном времени.

Флуоресцентные изображения фиксированных везикул Y-F-P-P-R-P-C, а также соответствующие иммунофлуоресцентные изображения кинезина light chain one и dine выравниваются по хромографу. Это увеличение показывает иммунофлуоресцентные сигналы каждого из трех каналов с назначениями функций 2D gian. Этот график представляет собой количественную оценку колокализации между везикулами Y-F-P-P-R-P-C, легкой цепью кинезина и дином в нейронах дикого типа и в нейронах, лишенных тяжелой цепи КИНЕЗИНА.

Относительное количество кинезина в легкой цепи 1 и дине, связанное с везикулами Y-F-P-P-R-P-C, получено из амплитуд Гаусса и построено на графике для тщательного изучения возможных корреляций между относительными моторными величинами и направленностью движения. Этот пример нейронов дикого типа показывает, что везикулы Y-F-P-P-R-P-C, которые являются движущимися или неподвижными, связаны либо с одной из легких цепей KINESIN, либо с обедом, либо с обоими После освоения этой техники можно выполнить в течение трех дней. В дополнение к примерно 10 дням подготовки микрофилликовых устройств и первичного нейрона до ЭМ, в течение трех дней вы сможете выполнять визуализацию иммунофлуоресцентного окрашивания в режиме реального времени и анализ данных.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как записывать в реальном времени движение флуоресцентно меченных грузов и нейронов, которые были выращены в микрофлюидных устройствах. Как зафиксировать С-клетки во время визуализации, как анализировать колокализацию как субпиксельное разрешение и как коррелировать колокализацию груза и молекулярных моторных белков с движением груза.