Визуализация уровня кальция в нейронах

Визуализация кальция — это чрезвычайно полезный метод исследования многообразных функций ионов кальция в работе нейронов. Ионы кальция создают множество внутриклеточных сигналов, которые контролируют ключевые функции, такие как высвобождение нейромедиаторов из синаптических везикул. Методы визуализации кальция позволяют напрямую измерять динамический поток кальция внутри нейронов и нейронной ткани. В этом видео представлен обзор принципа работы индикаторных красителей кальция, описан процесс проведения эксперимента по визуализации кальция, а в завершение обсуждаются некоторые области применения данного метода.

Для начала разберем биохимические принципы работы красителей-индикаторов кальция.

Красители-индикаторы кальция представляют собой модифицированные молекулы хелаторов, такие как Fura-2, которые состоят из двух основных компонентов. Первый — это хелатирующий центр, который селективно связывает кальций. Второй — флуоресцентный центр, который излучает свет на определенной длине волны при освещении ультрафиолетовым светом с определенной длиной волны возбуждения.

Связывание кальция с красителем изменяет его флуоресцентные свойства, что позволяет количественно оценить изменения концентрации кальция; здесь это представлено разницей в интенсивности флуоресценции, излучаемой данным нейроном на двух разных длинах волн возбуждения.

Большинство красителей-индикаторов кальция подвергаются дополнительной модификации, чтобы они могли легко проникать через клеточную мембрану; их вводят либо вместе с нейронами в раствор ванны, либо вводят непосредственно в ткани мозга при исследованиях на целых животных.

Некоторые красители обладают свойствами двойного возбуждения или двойной эмиссии в зависимости от того, связан кальций или нет. Рассмотрим, например, краситель Fura-2, который имеет разную длину волны возбуждения в связанном и несвязанном с кальцием состояниях. Рассчитывая отношение интенсивности эмиссии на двух длинах волн возбуждения, можно получить гораздо более точную оценку концентрации кальция.

Красители с двойным возбуждением или эмиссией, такие как Fura-2, называются рациометрическими индикаторами кальция. Существуют и нерациометрические красители с одной длиной волны возбуждения и эмиссии. Однако они более подвержены фотовыгоранию — ослаблению или потере флуоресценции при длительном воздействии света.

Ключевым этапом перед использованием красителя в эксперименте является калибровка флуоресцентных измерений с помощью растворов с известными концентрациями кальция. Это позволит ученым точно оценивать внутриклеточную концентрацию кальция на основании измеренной интенсивности эмиссии в ходе экспериментов.

Теперь, когда мы изучили принцип работы индикаторов кальция, давайте разберем, как визуализировать поток кальция в нейронах, выращенных на подложке.

Начните с приготовления выбранного красителя-индикатора кальция, например Fura-2, и смешайте его с соответствующими физиологическими растворами. Перемешайте раствор на вортексе для обеспечения однородности. После достаточного перемешивания перелейте раствор в чашку. Теперь поместите покровное стекло с культивируемыми нейронами в чашку с раствором красителя. Далее инкубируйте нейроны в темноте в течение необходимого времени при соответствующей температуре, которая в данном случае составляет 30 минут при 37 ˚C. По истечении периода инкубации перенесите покровное стекло в чашку без красителя.

Следующим шагом является установка покровного стекла в измерительную камеру микроскопа. После установки подключите входную линию системы перфузии и медленно заполните камеру. Закрепите камеру на предметном столике микроскопа и установите выходные линии перфузии, обеспечив непрерывный поток по всей системе перфузии.

Теперь, когда предметный столик микроскопа готов, настройте фокус на нейронах, используя видимый свет. Проверьте краситель, освещая клетки на длинах волн 340 и 380 nm. Напомним, что в случае с Fura-2 неактивированные нейроны должны излучать больше света при возбуждении 380 nm, так как кальций не связан.

Затем, перед началом эксперимента, настройте параметры камеры для оптимизации динамического диапазона. Снимите изображение на каждой длине волны, затем с помощью инструмента выделения области интереса (ROI) измерьте интенсивность фона на каждой длине волны. Введите значения фона в управляющее программное обеспечение, чтобы их можно было вычитать из последующих изображений.

После завершения первоначальной настройки выберите примерно пять полей зрения, которые будут визуализироваться в ходе эксперимента, и сохраните их координаты в управляющем ПО. Во время эксперимента автоматизированный столик перемещается к каждому полю, фиксирует отношение интенсивности поля на длинах волн 340 и 380 nm, а затем переходит к следующему полю, пока не будут собраны данные по всем областям.

В некоторых экспериментах в перфузионную жидкость добавляется фармакологический агент, вызывающий изменение уровней внутриклеточного кальция. Раствор с высоким содержанием калия, который деполяризует нейроны, может вызвать повышение концентрации внутриклеточного кальция, как показано на этой серии изображений с временным интервалом, и служит хорошим положительным контролем. После завершения сбора данных переходите к анализу.

Для анализа результатов с помощью программного обеспечения выделите области интереса, включающие нейроны или их части. Затем используйте ПО для измерения рациометрической интенсивности изображений на обеих длинах волн в каждой ROI на всех собранных снимках. На основе этой информации можно провести количественную оценку изменений концентрации внутриклеточного кальция с течением времени.

Теперь, когда вы понимаете, как осуществляется кальциевый имиджинг в нейронах, давайте рассмотрим некоторые способы применения этого ценного метода в современных исследованиях.

Прежде всего, кальциевый имиджинг используется для изучения того, как меняется концентрация внутриклеточного кальция в зависимости от нейронной активности.

В данном исследовании отдельные нейроны заполняли красителем-индикатором кальция во время записи методом patch-clamp. Точный контроль мембранного потенциала, обеспечиваемый техникой patch-clamp, позволяет получить представление о динамике потока кальция.

Кальциевый имиджинг позволяет исследователям изучать высокосинхронную сетевую активность нейронов.

Здесь нейробиологи использовали кальциевый имиджинг для оценки флуоресцентного сигнала 40 нейронов. На основании этой информации можно определить свойства сети, такие как распространение сигнала и нейронные корреляции.

Динамика кальция также может показать, как нейроны обрабатывают сигналы из внешнего мира, например, запахи.

В этом эксперименте органы, воспринимающие феромоны, извлеченные из носа мыши, выращивали в культуре. Нейроны в ткани инкубировали с Fura-2 и подвергали имиджингу при воздействии таких одорантов, как моча или очищенные феромоны. Манипулируя экспрессией белков рецепторов одорантов в обонятельных нейронах, можно напрямую визуализировать, как один белок влияет на способность клетки реагировать на определенные запахи.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по кальциевому имиджингу в нейронах. В этом ролике мы обсудили принципы работы данного метода и рассмотрели типичный эксперимент.

Учитывая множество важных функций кальция, кальциевый имиджинг останется незаменимым инструментом для изучения нейронов и механизмов их взаимодействия друг с другом.

Спасибо за просмотр!