1.3: Визуализация кальция в нейронах

Визуализация кальция является чрезвычайно полезным методом для исследования разнообразия ролей, которые ионы кальция играют в функционировании нейронов. Ионы кальция генерируют множество внутриклеточных сигналов, которые контролируют ключевые функции, такие как высвобождение нейротрансмиттеров из синаптических везикул. Методы визуализации кальция позволяют напрямую измерять динамический поток кальция в нейронах и нейронной ткани. В этом видео представлен обзор того, как работают индикаторные красители кальция, как завершается эксперимент по визуализации кальция, и, наконец, обсуждаются некоторые области применения этого метода.

Для начала рассмотрим биохимические принципы содержания кальциевых индикаторных красителей.

Индикаторные красители кальция представляют собой модифицированные молекулы хелаторов, такие как Fura-2, которые состоят из двух основных компонентов. Первый – это хелатный сайт, который избирательно связывает кальций. Второй представляет собой флуоресцентный участок, который излучает свет с определенной длиной волны при освещении возбуждающей длиной волны ультрафиолетового света.

Связывание кальция с красителем изменяет его флуоресцентные свойства, что позволяет количественно оценить изменения концентрации кальция, которые здесь представлены разницей в интенсивности флуоресценции, излучаемой этим нейроном на двух разных длинах волн возбуждения.

Большинство индикаторных красителей кальция дополнительно модифицируются, чтобы они могли легко проникать через клеточную мембрану, и вводятся либо в раствор ванны с нейронами, либо вводятся в ткани мозга для исследований на животных.

Некоторые красители обладают двойным возбуждением или двойным излучением в зависимости от того, связан ли кальций. Возьмем, к примеру, краситель Fura-2, который имеет разную длину волны возбуждения, когда кальций связан, и когда он не связан. Взяв отношение интенсивности излучения на двух длинах волн возбуждения, можно сделать гораздо более точную оценку концентрации кальция.

Красители с двойным возбуждением или выбросом, такие как Fura-2, называются ратиометрическими показателями кальция. Существуют нетратиметрические красители, которые имеют одинарную длину волны возбуждения и излучения. Однако они более восприимчивы к фотообесцвечиванию, которое представляет собой ослабление или потерю флуоресценции при длительном воздействии света.

Ключевым шагом перед использованием красителя в эксперименте является калибровка измерений флуоресценции, полученных от красителя, с растворами известных концентраций кальция. Это позволит ученым точно оценивать внутриклеточные концентрации кальция на основе измеренной интенсивности излучения во время экспериментов.

Теперь, когда мы узнали, как работают показатели кальция, давайте рассмотрим, как визуализировать поток кальция в пластинчатых нейронах.

Начните с приготовления красителя для индикатора кальция по выбору, такого как Fura-2, и смешивания его с дополнительными физиологическими растворами. Сделайте раствор вихревым, чтобы обеспечить правильное перемешивание. После достаточного перемешивания переложите в блюдо. Теперь поместите покровную крышку с культивированными нейронами в чашку с раствором красителя. Далее инкубируйте нейроны в темноте в течение необходимого времени при соответствующей температуре, которая в данном случае составляет 30 минут при 37 °C. По истечении инкубационного периода переложите покровный лист в посуду без красителя.

Следующим шагом является установка покровного стекла на камеру визуализации микроскопа. После установки подключите входную линию перфузионной системы и медленно заполните камеру. Закрепите камеру на предметном столике микроскопа и установите выходные перфузионные линии, обеспечивающие непрерывный поток по всей системе перфузии.

Теперь, когда столик для микроскопа готов, сфокусируйте нейроны с помощью видимого света. Протестируйте краситель, освещая клетки на длинах волн 340 и 380 нм. Напомним, что при использовании Fura-2 неактивированные нейроны должны излучать больше света при возбуждении на 380 нм, так как кальций не связывается.

Далее отрегулируйте настройки камеры с целью оптимизации динамического диапазона перед началом эксперимента. Соберите изображение на каждой длине волны, затем используйте интересующую область или инструмент ROI для измерения интенсивности фона на каждой длине волны. Введите значения фона в управляющее программное обеспечение, чтобы их можно было вычесть из последующих изображений.

После завершения первоначальной настройки выберите около пяти полей зрения, которые должны быть отображены для эксперимента, и сохраните координаты в управляющем программном обеспечении. В ходе эксперимента автоматизированный столик перемещается к полю, собирает отношение напряженности поля на длинах волн 340 и 380 нм и переходит к следующему полю, пока не будут собраны все поля.

В некоторых экспериментах в перфузионную жидкость добавляют фармакологическое средство, которое вызывает изменение внутриклеточного уровня кальция. Раствор с высоким содержанием калия, который деполяризует нейроны, может вызвать повышение внутриклеточной концентрации кальция, как показано на этой серии изображений, и служит хорошим положительным контролем. После того, как сбор данных будет завершен, перейдем к анализу.

Чтобы проанализировать результаты, выберите области интереса, которые включают нейроны или части нейронов с помощью программного обеспечения. Затем используйте программное обеспечение для измерения ратометрической интенсивности изображения с обеих длин волн на каждой ROI во всех собранных изображениях. С помощью этой информации можно провести количественную оценку изменений внутриклеточных концентраций кальция с течением времени.

Теперь, когда у вас есть представление о том, как достигается визуализация кальция в нейронах, давайте рассмотрим некоторые из способов, которыми этот ценный метод применяется в современных исследованиях.

В первую очередь, визуализация кальция используется для изучения того, как внутриклеточный поток кальция связан с нейронной активностью.

В этом исследовании отдельные нейроны были заполнены красителем-индикатором кальция во время записи патч-зажима. Точное управление мембранным потенциалом, обеспечиваемое с помощью технологии патч-хомута, позволяет получить представление о динамике потока кальция.

Визуализация кальция позволяет исследователям исследовать высокосинхронную сетевую активность нейронов.

Здесь нейробиологи использовали кальциевую визуализацию для оценки флуоресцентного сигнала 40 нейронов. С помощью этой информации можно определить свойства сети, такие как распространение сигнала и нейронные корреляции.

Динамика кальция также может показать, как нейроны обрабатывают сигналы из внешнего мира, такие как запахи.

В этом эксперименте феромонные чувствительные органы, извлеченные из носа мыши, были выращены в культуре. Нейроны в ткани инкубировали с Fura-2 и визуализировали в то время, как им вводили пахучие вещества, такие как моча или очищенные феромоны. Манипулируя экспрессией белков рецепторов запаха в обонятельных нейронах, можно напрямую визуализировать, как один белок влияет на способность клетки реагировать на уникальные запахи.

Вы только что посмотрели введение JoVE в визуализацию кальция в нейронах. В этом видео мы обсудили свойства, лежащие в основе этой техники, и рассмотрели типичный эксперимент.

Учитывая множество важных ролей кальция, визуализация кальция останется жизненно важным инструментом в понимании нейронов и того, как они взаимодействуют друг с другом.

Спасибо за просмотр!