Стереотаксическая хирургия на грызунах

Стереотаксическая хирургия представляет собой эффективный метод, используемый для манипуляций с мозгом живых животных. Доступ к областям, расположенным глубоко в неповрежденном мозге, представляет собой определенную проблему, так как обычно хирургическую цель невозможно определить визуально. Стереотаксия, или стереотаксическая хирургия, была разработана для воздействия на отдельные области мозга на основе знания их пространственного расположения относительно видимых ориентиров. С помощью трехмерной системы координат инструменты можно направить в конкретные точки для измерения активности мозга, создания повреждения (лезии) или проведения генетических манипуляций. В данном видео будут рассмотрены принципы стереотаксической хирургии, продемонстрированы основные этапы процедуры и обсуждены различные варианты применения этого метода.

Прежде чем перейти к деталям процедуры, рассмотрим основные принципы и инструменты данного метода. Для начала отметим, что стереотаксис основан на локализации целевого отдела мозга по треммерным осям. Для этой цели используется стереотаксический атлас. Данный документ представляет собой 3D-реконструкцию мозга, полученную на основе серийных срезов окрашенных образцов мозга.

В этой системе координат пространственные соотношения выражаются с помощью набора из трех осей: передне-задней, медиально-латеральной и дорсо-вентральной. Чтобы определить местоположение интересующей области, найдите соответствующий отдел мозга в атласе и используйте сетку для расчета соответствующих медиолатеральных и дорсовентральных координат. Переднезадняя координата указывается в нижней или верхней части страницы. Эта координата измеряется от ориентиров на черепе, образованных пересечением костных пластин, которые называются швами. Самый заметный ориентир, брегма, определяется как точка пересечения сагиттального шва с венечным швом. Точка, известная как лямбда, расположена более каудально; в ней сагиттальный шов пересекается с лямбдовидным швом.

Для точного попадания в расчетную точку во время операции используется устройство, называемое стереотаксической рамой. Рама состоит из основного каркаса, микроманипулятора и держателя зонда, который прикреплен к зажимному креплению. Резцовые и ушные фиксаторы обеспечивают контакт с животным, чтобы удерживать голову в неподвижном положении. Микроманипулятор используется для точного перемещения хирургических зондов в заданные координаты внутри мозга и оснащен скользящими шкалами нониуса для точного измерения расстояния во всех трех измерениях.

Чтобы считать значение по шкале нониуса, сначала определите положение линии 0 относительно меток в правой части шкалы. Эта часть шкалы размечена с шагом 10 millimeter, так что 1 соответствует 10, а 2 — 20. Положение метки 0 здесь показывает, что значение находится между 10 и 11 mm. Чтобы определить первую цифру после десятичной точки, найдите на левой шкале линию, которая лучше всего совпадает с меткой на правой стороне. Используйте левую шкалу, чтобы определить значение этой метки, которой в данном случае является 9, что дает итоговое значение 10.9 mm.

Теперь, когда вы ознакомились с основными принципами стереотаксиса, давайте разберем, как проводится хирургическая процедура. Перед операцией кожу головы анестезированного животного выбривают и дезинфицируют. Чтобы зафиксировать животное в стереотаксической раме, ушные фиксаторы осторожно вводят в ушные раковины, а передние зубы фиксируют в резцовых зажимах. Для предотвращения пересыхания роговицы во время операции наносят глазную мазь.

Для обнажения черепа скальпелем делают небольшой разрез. Осторожно раздвигают мышечную ткань и очищают поверхность черепа. Затем с помощью микromanипулятора опускают зонд до точки брегма и фиксируют ее дорсовентральную координату. После этого зонд поднимают и повторяют процедуру в точке лямбда. Если разница в измерениях между лямбда и дорсовентральной координатой брегма составляет менее 0.1 mm, череп считается выровненным, и можно приступать к дальнейшим действиям. В противном случае необходимо поднять или опустить резцовый зажим и повторить измерения.

После выравнивания головного мозга возвращаются к точке брегма и записывают медиолатеральную и антеропостериорную координаты. На основании целевых координат из атласа мозга вычисляют смещения, необходимые для достижения нужной точки, и перемещают зонд в целевое положение. Эту точку отмечают на черепе и с помощью дрели аккуратно просверливают отверстие в кости.

Сразу под черепом находится твердая мозговая оболочка — плотная прочная мембрана, которую можно осторожно рассечь кончиком тонкой иглы.

Затем рычаг микromanипулятора устанавливают в положение, позволяющее опустить зонд до заданной дорсовентральной координаты, после чего можно проводить необходимые манипуляции.

Теперь, когда вы ознакомились с основными этапами процедуры, давайте рассмотрим некоторые из многочисленных способов применения стереотаксической хирургии нейробиологами для поиска ответов на вопросы в лабораторных условиях.

Для начала отметим, что стереотаксис чрезвычайно полезен для доставки экспериментальных агентов в определенные области мозга. К таким агентам могут относиться красители-трейсеры, используемые для визуализации нейронных проекций и связей, химические соединения или реагенты для генетической манипуляции нейронами. Например, инъекция генетически модифицированных вирусов обеспечит доставку интересующего гена в инфицированные клетки. В данном случае вирус был введен в гиппокамп, что привело к экспрессии GFP в небольшой популяции нейронов.

С другой стороны, вирусная доставка малых интерферирующих РНК может предотвратить экспрессию нужных белков. В этом примере экспрессия белка SOD1 была подавлена в различных областях мозга после стереотаксической инъекции в боковой желудочек.

Кроме того, стереотаксическая хирургия может использоваться для размещения электродов в мозге с целью регистрации электрических сигналов, сопровождающих нейронную активность. После того как животное восстановится после хирургической операции, электроды можно подключить к системам электрофизиологической регистрации, чтобы наблюдать за активностью нейронов, пока мышь находится в состоянии свободного поведения.

Помимо измерения нейронной активности, стереотаксическая хирургия играет важную роль в микродиализе. Этот метод позволяет осуществлять непрерывный мониторинг концентраций лекарственных средств, нейромедиаторов или метаболитов в тканях мозга бодрствующих животных. Для этого в определенную область мозга имплантируется небольшой заполненный жидкостью зонд с полупроницаемой мембраной на конце. Малые растворенные вещества, включая нейромедиаторы, гормоны и лекарства, диффундируют в зонд, где они могут быть собраны для анализа. В данном эксперименте измерялась концентрация глюкозы в гиппокампе как показатель локальной нейронной активности, пока крысы выполняли задание, требующее использования пространственной рабочей памяти.

Вы только что посмотрели видео JoVE о стереотаксической хирургии. В этом видео мы рассмотрели принципы и методы данной процедуры, а также ее многочисленные применения в нейробиологических лабораториях.

Спасибо за просмотр!