Гистологическое окрашивание нервной ткани

Срезы или секции тканей головного мозга представляют собой богатый материал для изучения структуры и функций мозга. Однако необработанный мозг выглядит как визуально однородная ткань, подобно чистому холсту. Окрашивание — это способ «раскрасить» мозг, чтобы четко визуализировать клеточные, структурные и молекулярные компоненты органа. Хотя большинство методов окрашивания основано на общих гистологических принципах, каждый подход имеет свою уникальную морфологическую цель. В этом видео будут изложены общие принципы гистологии мозга, продемонстрированы некоторые распространенные методы окрашивания и рассмотрены несколько вариантов применения этих методов в современных нейробиологических лабораториях.

Прежде чем обсуждать проведение процедур неврологического окрашивания, давайте рассмотрим цели этих методов.

Гистологические окраски обычно используются для создания контраста, что позволяет выявить особенности, которые невозможно различить в неокрашенной ткани. Например, для визуализации тел нейронов (сом), из которых состоит серое вещество нервной системы, доступно несколько методов окрашивания. Красители, используемые при окрашивании по Нисслю, связываются с нуклеиновыми кислотами, окрашивая сомы в пурпурный цвет и проявляя организацию нейронов.

Для изучения белого вещества можно окрасить миелин — оболочку из жирных кислот, окружающую аксоны, — с помощью таких красителей, как Luxol Fast Blue. Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание позволяет выделить молекулярные мишени, присутствующие в специфических типах клеток. Этот метод основан на специфичности взаимодействия между антителами и молекулярными мишенями, называемыми антигенами. Использование антител, конъюгированных с ферментами или флуоресцентными соединениями, позволяет исследователям визуализировать сайты их связывания с помощью ферментативных реакций или флуоресценции.

Теперь, когда вы ознакомились с принципом окрашивания срезов, рассмотрим стандартные гистологические этапы, которые предшествуют окрашиванию тканей мозга и обеспечивают оптимальные условия для визуализации.

Для сохранения структуры ткани первым делом проводят перфузию мозга — это означает, что кровь вымывается из мозга, а сосудистая система животного используется для доставки химического фиксатора. После препарирования мозг полностью погружают в фиксатор для завершения процесса консервации.

Затем образец заливают в среду с механическими свойствами, близкими к свойствам ткани мозга, например, в парафин. После заливки мозг нарезают на тонкие срезы с помощью прибора, называемого микротомом. Полученные срезы наносят на предметные стекла и высушивают.

Поскольку большинство красителей имеют водную основу, перед началом окрашивания ткань необходимо депарафинизировать и регидратировать. Для этого предметные стекла промывают в ксилоле для растворения парафина, после чего проводят постепенную регидратацию через серию растворов этанола с уменьшающейся концентрацией. Эту процедуру следует выполнять в вытяжном шкафу с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.

После подготовки ткани мозга можно приступать к процедуре окрашивания.

Первый этап, называемый блокировкой, снижает фоновое окрашивание, вызванное неспецифическим связыванием антител. Воздействие сыворотки на срез позволяет достичь этого за счет введения немеченых антител, которые связываются с нецелевыми участками. После блокировки продолжительностью от 30 минут до ночи ткань готова к инкубации с первичными антителами, которые связываются со специфическими молекулярными мишенями.

Антитела обычно разводят в блокирующем растворе, содержащем детергент, который разрушает клеточные мембраны и позволяет антителам проникать в цитоплазму.

После инкубации в течение ночи избыток первичных антител удаляют путем коротких промывок в буфере. Затем вводят вторичные антитела, конъюгированные с ферментами или флуорофорами, для специфического мечения первичных антител. Спустя несколько часов избыток антител удаляют путем многократной смены буфера.

Теперь, когда мишени помечены, обсудим способы их обнаружения. Для вторичных антител, конъюгированных с ферментами, это достигается путем введения хромогенного субстрата. При взаимодействии субстрата с ферментом происходит изменение цвета, отсюда и термин «хромогенный». Как только достигается желаемое окрашивание, обычно примерно через 2 минуты, реакцию останавливают, быстро погружая срезы в воду.

После окрашивания антителами может потребоваться дополнительный этап для обеспечения нейроанатомического контекста полученных результатов. Например, для повышения контрастности ткани можно использовать окрашивание по Нисслю. Этот метод основан на применении основных красителей, таких как крезиловый фиолетовый, которые взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами.

На первом этапе раствор красителя фильтруют для удаления нерастворенных кристаллов. Затем предметные стекла инкубируют в красителе до достижения желаемого контраста. После этого срезы промывают несколько раз в сменной воде, чтобы остановить процесс окрашивания.

Затем стекла погружают в серию спиртов для удаления излишков красителя и дегидратации срезов. После дегидратации срезы осветляют ксилолом, который удаляет спирт и улучшает визуализацию, так как обладает дифракционными свойствами света, схожими со свойствами ткани.

Для сохранения окрашенных срезов для последующего анализа их заключают под покровное стекло, используя перманентный средство для montaje, и оставляют высыхать на ночь.

Теперь, когда мы описали процедуры и цели окрашивания, рассмотрим некоторые варианты его применения.

Прежде всего, гистологическое окрашивание регулярно используется для визуализации отдельных нейронов. В свою очередь, визуализация необходима для таких методов, как лазерная захватная микродиссекция, при которой исследователи используют лазер для изолирования специфических клеток, выращенных на тонкой пленке. Из окрашенных и диссекированных клеток можно выделить генетический материал, что позволяет исследователям изучать экспрессию генов, специфичных для нейронов.

Окрашивание также может применяться для характеристики морфологических особенностей отдельных нейронов. В данном эксперименте выполняется иммуногистохимия клеток, экспрессирующих GFP, для визуализации дендритов, формирующих синапсы. Окрашивание сравнивается между нормальными и активированными клетками, что показывает, что дендриты претерпевают множественные изменения в ответ на активирующие стимулы.

Наконец, благодаря специфичности ИГХ, экспрессия отдельных белков может быть использована для определения локализации и идентификации уникальных популяций клеток в нервной системе. Например, окрашивание мозжечка мыши антителами к зебрину 2 выявляет расположение специализированных нейронов, известных как клетки Пуркинье.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по направленному окрашиванию срезов головного мозга. В этом ролике мы продемонстрировали общие методы и цели окрашивания, а также конкретные процедуры ИГХ и окрашивания по Нисслю.

Спасибо за просмотр!