Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии и пользовательскую базу данных для характеристики бактерий из числа коренных народов уникального пещерного окружающей среды (Kartchner Пещеры, AZ, США)

Общая цель данной процедуры заключается в разработке, применении и демонстрации подробной процедуры идентификации бактерий на основе библиотеки с использованием MALDI для масс-спектрометрии. Это достигается путем получения массовых спектров бактерий с помощью масс-спектрометра Малоффа. В этом исследовании собираются масс-спектры 15 бактерий, выделенных из едкой среды, образуются пиковые формы, характерные узоры или отпечатки пальцев анализируемых бактерий.

Затем эти масс-спектры импортируются в программное обеспечение и создается база данных моделей. Затем опорные масс-спектры в базе данных модели обрабатываются и анализируются с помощью кластерного анализа, сопоставления пиков и статистического анализа. Наконец, масс-спектры слепо кодированных бактерий, которые случайным образом выбираются из этих 15 бактерий, снова собираются и сравниваются с референсными спектрами в базе данных модели для результатов идентификации показывают, что бактерии могут быть правильно идентифицированы либо на основе коэффициентов сходства, либо на основе потенциальных биомаркеров и пиковых классов.

Начните эту процедуру с нанесения одного микролитра белкового экстракта, не содержащего жизнеспособных клеток, на мишенную пластину Maldi из нержавеющей стали и дайте ей высохнуть. Затем засыпьте высушенный белковый экстракт одним микролитром матричного раствора и дайте ему высохнуть. Затем нанесите один микролитр стандарта CBR на целевую пластину после того, как она высохнет, покройте CBR одним микролитром матричного раствора и дайте ему высохнуть.

Наконец, нанесите два микролитра матричного раствора на целевую пластину в качестве отрицательного контроля. Используйте многомасс-спектрометр, оснащенный азотным лазером и управляемый с помощью программного обеспечения Bruker flex control. Соберите каждый масс-спектр в положительном линейном режиме путем накопления 500 лазерных выстрелов с шагом 100 выстрелов.

Установите ионный источник одним напряжением на 20, киловольт на ионный источник, два напряжения на 18,15 киловольт и напряжением линзы на 9,05 киловольт. Эти параметры специфичны для инструмента и могут потребовать оптимизации. Установите диапазон массы к заряду для автоматической оценки спектра от двух до 20 килодальтон на зарядку.

Затем установите минимальный порог разрешения на уровне 100. Выберите алгоритм обнаружения пиков OID. Установите порог отношения сигнал/шум равным два, а минимальный порог интенсивности — 100.

Наконец, установите пиковое накопление равным 500 для проектирования базы данных. Создайте новую базу данных в bio numerics 7.1 с помощью мастера создания новой базы данных. Затем создайте тип эксперимента со спектром, например maldi, с помощью команд на панели типов экспериментов.

Затем создайте уровни с помощью панели дизайна базы данных, перейдите в меню базы данных и добавьте новые уровни с помощью команды добавить новый уровень здесь. Создайте уровень вида, уровень биологической репликации и технический уровень. Импорт исходных масс-спектров.

Сначала экспортируйте необработанные масс-спектры в виде текстовых файлов с помощью флекс-анализа, перемещаясь по меню «Файл» и выбирая команду «Экспорт масс-спектра». Затем импортируйте необработанные масс-спектры в базу данных на уровне технических реплик. Предварительная обработка исходных масс-спектров путем импорта и повторной выборки с использованием алгоритма квадратичной аппроксимации.

Затем выполните базовое вычитание с помощью вращающегося диска размером 50 пунктов, вычислите шум с помощью непрерывного вейвлет-преобразования или CWT. Сгладьте спектры с помощью окна Кайзера с размером окна 20 пунктов и бета 10 пунктов. Затем выполните второе базовое вычитание с помощью прокатного диска размером 200 пунктов.

Наконец, обнаружение пиков с помощью CWT с минимальным отношением сигнал/шум 10 после предварительной обработки безопасных характеристических шаблонов каждого массового спектра, таких как списки пиков, содержащие размеры пиков, пиковые интенсивности и отношение сигнал/шум. Далее создайте составные масс-спектры из предварительно обработанных спектров с помощью команды summarized в меню анализа. Выберите биологическую репликацию в качестве целевого уровня. Здесь.

Объедините масс-спектры 10 технических реплик одной и той же колонии, чтобы получить составной масс-спектр для этой колонии, в результате чего получится три составных масс-спектра для этого изолята на биологическом уровне реплик. Наконец, суммируйте три составных спектра, чтобы создать один составной спектр для этого изолята на видовом уровне. Чтобы выполнить кластерный анализ на основе сходства и многомерное масштабирование, создайте группы с цветами.

Сначала выберите три биологических составных масс-спектра, а затем нажмите команду «Создать новую группу из выбора» в меню группы, чтобы создать группу для соответствующего изолята. Затем разработайте цвет, который будет автоматически использоваться для этих трех масс-спектров. Выполните кластерный анализ, перейдя в меню кластеризации и выбрав команду вычислить кластерный анализ.

В настройках сравнения на первой странице выберите корреляцию Пирсона и оставьте другие параметры по умолчанию. На второй странице выберите метод группы невзвешенных пар со средним арифметическим. Затем нажмите «Готово».

Получите график многомерного масштабирования с помощью команды многомерного масштабирования в меню статистики для выполнения сопоставления пиков. Нажмите на тип спектра maldi на панели экспериментов. Затем выберите макет.

Показать изображение, показаны отдельные пики спектров. Затем выполните сопоставление пиков с помощью команды do peak matching в меню спектров для определения классов пиков, выполните двустороннюю кластеризацию, щелкнув матрицу статистики. Добыча. Интенсивность пиков, сопоставленных с классами пиков, представлена в виде тепловой карты для идентификации бактерий методом на основе коэффициента подобия, создания сравнения и генерации рограммы на основе масс-спектров на техническом уровне репликации, как это выполняется для кластерного анализа, сохранения рограммы для сравнения сходства.

Выберите неизвестный масс-спектр и нажмите на анализ. Определите выбранные записи. Появится диалоговое окно идентификации.

Выберите тип классификатора на основе сравнения и нажмите кнопку Далее. На следующей странице выберите сохраненный грамм в качестве эталонного сравнения, а затем нажмите «Далее». Выберите базовое сходство в качестве метода идентификации и снова, нажмите далее, выберите максимальное сходство в качестве метода оценки.

Введите соответствующие пороговые значения и минимальные значения разницы для каждого параметра, а затем нажмите кнопку Далее. После завершения расчетов на панели результатов появится окно идентификации. В списке перечислены члены базы данных, которые лучше всего соответствуют неизвестным.

Рограмма, основанная на кластерном анализе, показывает сходство между каждым изолятом в базе данных. Набор данных содержит спектры 15 различных видов с тремя составными спектрами для каждого вида. Двусторонний кластерный анализ может помочь исследователям определить потенциальные биомаркеры для вида или штаммов внутри вида.

Здесь пиковая интенсивность представлена цветами, зеленый — низкая интенсивность, а красный — высокая интенсивность. Наконец, на основе этого анализа масс-спектр неизвестного может быть сравнен с граммом и достигнута идентификация на основе коэффициента сходства.