Электропорация in utero у мышей
In utero электропорация является важным методом изучения молекулярных механизмов, определяющих пролиферацию, дифференцировку, миграцию и созревание кл…
Электропорация in utero является ключевым методом изучения молекулярных механизмов, управляющих нейроразвитием. Путем введения ДНК для изменения экспрессии генов в конкретных областях развивающегося мозга грызунов исследователи могут изучать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и созревание нейрональных клеток в условиях их естественной среды.
В данном видео будут представлены основные принципы электропорации in utero, общий обзор выполнения данной методики, а также области ее применения в нейробиологических исследованиях.
Прежде чем подробно рассмотреть выполнение данной процедуры, разберем основные принципы электропорации. В этом методе используются электрические импульсы, которые создают временные поры в клеточных мембранах, обеспечивая проникновение ДНК в клетку. Поскольку отрицательно заряженная ДНК перемещается к положительному электроду, воздействие на различные популяции клеток можно осуществлять в зависимости от ориентации электрического поля.
Хотя электропорация традиционно использовалась в in vitro исследования, научные достижения расширили область его применения до целых органов, включая органы развивающихся эмбрионов мыши in utero.
Электропорация in utero, в отличие от культур клеток или ex vivo методики обладают преимуществом, заключающимся в том, что трансфецированные клетки продолжают подвергаться воздействию всех физиологических стимулов, которые направляют нормальное развитие. Это особенно важно для головного мозга, где такие структуры, как аксоны, нуждаются в сигналах наведения от других типов клеток для правильного развития.
Развитие мозга, в частности, включает в себя программную серию событий пролиферации и миграции, что позволяет воздействовать на различные слои ткани в зависимости от времени проведения электропорации.
Наконец, наличие различных типов электродов позволяет исследователям воздействовать как на области, расположенные близко к поверхности мозга, так и на более глубокие структуры. Лопастные электроды используются при воздействии на поверхностные части мозга, такие как кора и гиппокамп, в то время как более мелкие игольчатые электроды применяются для воздействия на глубокие структуры, например, на таламус и гипоталамус.
Теперь, когда мы обсудили основные принципы метода, перейдем к подготовке, чтобы мы могли подробно рассмотреть хирургическую процедуру и электропорацию in utero.
Сначала стерилизуйте все инструменты и протрите рабочую область 70% этанолом. Затем приготовьте раствор для инъекций, растворив плазмидную ДНК в стерильном PBS, содержащем 0,1% Fast Green. Fast Green добавляется для визуализации раствора для инъекций в эмбрионе. Наконец, с помощью прибора для вытягивания игл необходимо изготовить ультратонкую иглу, чтобы уменьшить потерю амниотической жидкости и последующую гибель плода.
Теперь, когда все подготовлено, разберем основные этапы электропорации тканей мозга развивающихся грызунов. Начните с анестезии беременной самки с использованием 5% изофлурана, затем переведите ее на респираторную трубку, подающую 2,25% изофлурана на протяжении всей процедуры. Далее, для послеоперационного обезболивания, подкожно введите анальгетик, например, бупренорфин. Затем выбрейте шерсть на животе и стерилизуйте место разреза.
Чтобы хирургически обнажить матку, сделайте вертикальный разрез кожи по срединной линии и с помощью ножниц рассеките брюшину. Чтобы предотвратить высыхание эмбрионов, закройте отверстие марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе. Затем аккуратно извлеките цепочку эмбрионов из брюшной полости, стараясь поддерживать их во влажном состоянии, накрывая стерильным предварительно подогретым физиологическим раствором.
С помощью диссекционного микроскопа выберите эмбрионов, положение которых обеспечивает удобный доступ к мозгу. Пальцами или пинцетом зафиксируйте голову эмбриона и введите раствор ДНК через стенку матки в мозг. Разместите электроды по обе стороны головы, при этом положительный электрод должен быть направлен в сторону, в которую необходимо перенести ДНК при электропорации. После проведения электропорации всех подходящих по положению эмбрионов осторожно верните рог матки в брюшную полость.
Перед зашиванием разреза введите в полость 2–3 ml теплого физиологического раствора. Сшейте брюшину рассасывающимися швами, затем закройте кожу с помощью скоб. В завершение перенесите мышь в клетку с грелкой и проведите мониторинг состояния.
Теперь, когда мы рассмотрели процедуру электропорации in utero, давайте изучим некоторые варианты применения этого метода в дальнейших исследованиях.
Электропорация in utero является полезным инструментом для изучения того, как конкретные гены влияют на развитие нервной системы. Электропорированные конструкции могут обеспечивать гиперэкспрессию белков дикого типа или мутантных белков, либо полностью блокировать экспрессию белков. После этого неврологические фенотипы можно оценить как на микроскопическом, так и на организменном уровне. Например, данные исследователи установили, что транзиторная гиперэкспрессия гена DISC-1, связанного с шизофренией, в развивающемся мозге мыши приводила к гиперчувствительности к амфетамину в более позднем возрасте.
Электропорация in utero также может быть полезна для визуализации конкретных популяций клеток и их связей путем доставки в нервную ткань последовательностей, кодирующих флуоресцентные белки. Например, эти исследователи ввели с помощью электропорации ген зеленого флуоресцентного белка в сетчатку на стадии E13.5 для изучения ганглиозных клеток сетчатки (RGCs), которые передают зрительную информацию от глаза в мозг. Исследование сетчатки на стадии E18.5 показывает, как этот метод может быть использован для отслеживания пути аксона RGC через зрительный нерв, зрительный перекрест и зрительный тракт.
Наконец, многие важные события в развитии нервной системы происходят после рождения, что побудило ученых разработать модифицированный метод, называемый электропорацией in vivo. Эта процедура включает те же основные этапы, что и электропорация in utero, но обычно проводится в течение первых нескольких дней после рождения. Постнатальные генетические манипуляции особенно полезны для изучения типов клеток, которые появляются на более поздних стадиях, таких как клетки в обонятельной луковице, показанной здесь.
Вы только что посмотрели видео JoVE по электропорации in utero. В этом видео были представлены основные принципы и общий обзор метода проведения электропорации in utero, а также несколько последующих приложений, которые позволяют исследователям изучать молекулярные механизмы, управляющие нейроразвитием.
Спасибо за просмотр!
Электропорация in utero является ключевым методом изучения молекулярных механизмов, управляющих нейроразвитием. Путем введения ДНК для изменения экспрессии генов в конкретных областях развивающегося мозга грызунов исследователи могут изучать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и созревание нейрональных клеток в условиях их естественной среды.
В данном видео будут представлены основные принципы электропорации in utero, общий обзор выполнения данной методики, а также области ее применения в нейробиологических исследованиях.
Прежде чем подробно рассмотреть выполнение данной процедуры, разберем основные принципы электропорации. В этом методе используются электрические импульсы, которые создают временные поры в клеточных мембранах, обеспечивая проникновение ДНК в клетку. Поскольку отрицательно заряженная ДНК перемещается к положительному электроду, воздействие на различные популяции клеток можно осуществлять в зависимости от ориентации электрического поля.
Хотя электропорация традиционно использовалась в in vitro исследования, научные достижения расширили область его применения до целых органов, включая органы развивающихся эмбрионов мыши in utero.
Электропорация in utero, в отличие от культур клеток или ex vivo методики обладают преимуществом, заключающимся в том, что трансфецированные клетки продолжают подвергаться воздействию всех физиологических стимулов, которые направляют нормальное развитие. Это особенно важно для головного мозга, где такие структуры, как аксоны, нуждаются в сигналах наведения от других типов клеток для правильного развития.
Развитие мозга, в частности, включает в себя программную серию событий пролиферации и миграции, что позволяет воздействовать на различные слои ткани в зависимости от времени проведения электропорации.
Наконец, наличие различных типов электродов позволяет исследователям воздействовать как на области, расположенные близко к поверхности мозга, так и на более глубокие структуры. Лопастные электроды используются при воздействии на поверхностные части мозга, такие как кора и гиппокамп, в то время как более мелкие игольчатые электроды применяются для воздействия на глубокие структуры, например, на таламус и гипоталамус.
Теперь, когда мы обсудили основные принципы метода, перейдем к подготовке, чтобы мы могли подробно рассмотреть хирургическую процедуру и электропорацию in utero.
Сначала стерилизуйте все инструменты и протрите рабочую область 70% этанолом. Затем приготовьте раствор для инъекций, растворив плазмидную ДНК в стерильном PBS, содержащем 0,1% Fast Green. Fast Green добавляется для визуализации раствора для инъекций в эмбрионе. Наконец, с помощью прибора для вытягивания игл необходимо изготовить ультратонкую иглу, чтобы уменьшить потерю амниотической жидкости и последующую гибель плода.
Теперь, когда все подготовлено, разберем основные этапы электропорации тканей мозга развивающихся грызунов. Начните с анестезии беременной самки с использованием 5% изофлурана, затем переведите ее на респираторную трубку, подающую 2,25% изофлурана на протяжении всей процедуры. Далее, для послеоперационного обезболивания, подкожно введите анальгетик, например, бупренорфин. Затем выбрейте шерсть на животе и стерилизуйте место разреза.
Чтобы хирургически обнажить матку, сделайте вертикальный разрез кожи по срединной линии и с помощью ножниц рассеките брюшину. Чтобы предотвратить высыхание эмбрионов, закройте отверстие марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе. Затем аккуратно извлеките цепочку эмбрионов из брюшной полости, стараясь поддерживать их во влажном состоянии, накрывая стерильным предварительно подогретым физиологическим раствором.
С помощью диссекционного микроскопа выберите эмбрионов, положение которых обеспечивает удобный доступ к мозгу. Пальцами или пинцетом зафиксируйте голову эмбриона и введите раствор ДНК через стенку матки в мозг. Разместите электроды по обе стороны головы, при этом положительный электрод должен быть направлен в сторону, в которую необходимо перенести ДНК при электропорации. После проведения электропорации всех подходящих по положению эмбрионов осторожно верните рог матки в брюшную полость.
Перед зашиванием разреза введите в полость 2–3 ml теплого физиологического раствора. Сшейте брюшину рассасывающимися швами, затем закройте кожу с помощью скоб. В завершение перенесите мышь в клетку с грелкой и проведите мониторинг состояния.
Теперь, когда мы рассмотрели процедуру электропорации in utero, давайте изучим некоторые варианты применения этого метода в дальнейших исследованиях.
Электропорация in utero является полезным инструментом для изучения того, как конкретные гены влияют на развитие нервной системы. Электропорированные конструкции могут обеспечивать гиперэкспрессию белков дикого типа или мутантных белков, либо полностью блокировать экспрессию белков. После этого неврологические фенотипы можно оценить как на микроскопическом, так и на организменном уровне. Например, данные исследователи установили, что транзиторная гиперэкспрессия гена DISC-1, связанного с шизофренией, в развивающемся мозге мыши приводила к гиперчувствительности к амфетамину в более позднем возрасте.
Электропорация in utero также может быть полезна для визуализации конкретных популяций клеток и их связей путем доставки в нервную ткань последовательностей, кодирующих флуоресцентные белки. Например, эти исследователи ввели с помощью электропорации ген зеленого флуоресцентного белка в сетчатку на стадии E13.5 для изучения ганглиозных клеток сетчатки (RGCs), которые передают зрительную информацию от глаза в мозг. Исследование сетчатки на стадии E18.5 показывает, как этот метод может быть использован для отслеживания пути аксона RGC через зрительный нерв, зрительный перекрест и зрительный тракт.
Наконец, многие важные события в развитии нервной системы происходят после рождения, что побудило ученых разработать модифицированный метод, называемый электропорацией in vivo. Эта процедура включает те же основные этапы, что и электропорация in utero, но обычно проводится в течение первых нескольких дней после рождения. Постнатальные генетические манипуляции особенно полезны для изучения типов клеток, которые появляются на более поздних стадиях, таких как клетки в обонятельной луковице, показанной здесь.
Вы только что посмотрели видео JoVE по электропорации in utero. В этом видео были представлены основные принципы и общий обзор метода проведения электропорации in utero, а также несколько последующих приложений, которые позволяют исследователям изучать молекулярные механизмы, управляющие нейроразвитием.
Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does electroporation create transient pores in cell membranes?
Electroporation uses electrical pulses to temporarily disrupt cell membranes, creating transient pores that allow DNA to enter cells. Since negatively charged DNA moves toward the positive electrode, researchers can target specific cell populations by positioning the electric field appropriately. This mechanism enables precise gene delivery to desired brain regions during development.
Q2: Why is in utero electroporation better than in vitro techniques for studying neural development?
In utero electroporation allows transfected cells to remain exposed to physiological cues that guide normal development, unlike cell culture or ex vivo techniques. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types to develop properly. Studying cells in their natural environment provides more accurate insights into developmental mechanisms.
Q3: What is the purpose of Fast Green in the injection solution?
Fast Green is added to the plasmid DNA injection solution at 0.1% concentration to allow visualization of the injection solution within the embryo. This dye enables researchers to confirm accurate DNA delivery to the target brain region during the surgical procedure, ensuring successful transfection of the desired neural tissue.
Q4: How do paddle electrodes and needle electrodes differ in their applications?
Paddle electrodes target superficial brain regions such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes access deeper structures like the thalamus and hypothalamus. The choice of electrode type depends on the location of the target tissue within the developing brain, allowing researchers to deliver genes to specific neural populations based on their anatomical position.
Q5: What are the main applications of in utero electroporation in neurobiology research?
In utero electroporation enables investigation of how specific genes contribute to neural development by overexpressing wildtype or mutant proteins or blocking protein expression. Researchers can also visualize specific cell populations and their connections by delivering fluorescent protein sequences into neural tissue. Additionally, neurological phenotypes can be assessed at microscopic or organismal levels to understand gene function in development.
Q6: How does the timing of electroporation allow targeting of different neural cell populations?
Brain development involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning different tissue layers can be targeted based on when electroporation is performed. By timing the procedure to coincide with specific developmental stages, researchers can selectively transfect neural progenitors, migrating neurons, or other cell types present at particular embryonic ages, enabling stage-specific genetic manipulation.
Q7: What is in vivo electroporation and how does it extend in utero electroporation research?
In vivo electroporation follows the same basic steps as in utero electroporation but is performed within the first few days after birth. This modified technique is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb, allowing researchers to investigate neural development events that occur after birth when in utero manipulation is no longer possible.