RESEARCH
Peer reviewed scientific video journal
Video encyclopedia of advanced research methods
Visualizing science through experiment videos
EDUCATION
Video textbooks for undergraduate courses
Visual demonstrations of key scientific experiments
BUSINESS
Video textbooks for business education
OTHERS
Interactive video based quizzes for formative assessments
Products
RESEARCH
JoVE Journal
Peer reviewed scientific video journal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Video encyclopedia of advanced research methods
EDUCATION
JoVE Core
Video textbooks for undergraduates
JoVE Science Education
Visual demonstrations of key scientific experiments
JoVE Lab Manual
Videos of experiments for undergraduate lab courses
BUSINESS
JoVE Business
Video textbooks for business education
Solutions
Language
ru_RU
Menu
Menu
Menu
Menu
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Внутриутробная электропорация является важным методом изучения молекулярных механизмов, которые управляют пролиферацией, дифференцировкой, миграцией и созреванием клеток во время развития нервной системы. Электропорация обеспечивает быструю и целенаправленную доставку материала в клетки с помощью электрических импульсов для создания переходных пор в клеточных мембранах. Хотя электропорация традиционно использовалась в исследованиях in vitro, научные достижения в настоящее время расширили ее использование на неповрежденные органы, такие как те, которые обнаруживаются в эмбрионах мышей, развивающихся в утробе матери.
Это видео представит ключевые принципы внутриутробной электропорации, а также рассмотрит основные хирургические методы, необходимые для доступа к развивающимся эмбрионам у беременной грызуны. Подробно описаны этапы инъекции и электропорации, а также важные соображения по направлению доставки генов в определенные области мозга. Наконец, представлены нейробиологические приложения внутриутробной электропорации, такие как исследование того, как определенные гены способствуют развитию нейронов и как формируются связи между развивающимися нейронами.
Внутриутробная электропорация является ключевым методом изучения молекулярных механизмов, которые управляют развитием нервной системы. Вводя ДНК для изменения экспрессии генов в определенных областях мозга развивающихся грызунов, исследователи могут изучать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и созревание нервных клеток в контексте их естественной среды.
В этом видео будут представлены ключевые принципы внутриутробной электропорации, общий обзор того, как выполнять эту технику, и ее применение в исследованиях в области нейробиологии.
Прежде чем мы углубимся в то, как выполнять эту процедуру, давайте сначала рассмотрим некоторые принципы электропорации. В этой процедуре используются электрические импульсы, которые создают переходные поры в клеточных мембранах, позволяя ДНК проникать в клетку. Поскольку отрицательно заряженная ДНК будет двигаться к положительному электроду, в зависимости от положения электрического поля можно воздействовать на различные клеточные популяции.
Хотя электропорация традиционно использовалась в исследованиях in vitro, научные достижения расширили ее использование на интактные органы, в том числе те, которые были обнаружены в эмбрионах мышей, развивающихся в утробе матери.
Внутриутробная электропорация, в отличие от клеточных культур или методов ex vivo, имеет то преимущество, что трансфицированные клетки будут продолжать подвергаться воздействию всех физиологических сигналов, которые управляют нормальным развитием. Это особенно важно для мозга, где такие структуры, как аксоны, нуждаются в направляющих сигналах от других типов клеток для правильного развития.
Развитие мозга, в частности, включает в себя запрограммированную серию событий пролиферации и миграции, а это означает, что различные слои тканей могут быть нацелены на основе времени электропорации.
Наконец, доступность различных типов электродов позволяет исследователям получить доступ как к областям у поверхности мозга, так и к более глубоким областям. Лопастные электроды используются при нацеливании на поверхностные части мозга, такие как кора головного мозга и гиппокамп, в то время как игольчатые электроды меньшего размера используются при нацеливании на глубокие структуры, такие как таламус и гипоталамус.
Теперь, когда мы обсудили некоторые основные принципы этой техники, давайте разберемся с подготовкой, чтобы углубиться в хирургическую процедуру и внутриутробную электропорацию.
Сначала простерилизуйте все инструменты и протрите операционную область 70% этанолом. Затем сделайте раствор для инъекций, растворив плазмидную ДНК в стерильном PBS, содержащем 0,1% Fast Green. Fast Green добавляется для визуализации раствора для инъекций в эмбрионе. Наконец, с помощью иглосъемника необходимо создать ультратонкую иглу, чтобы уменьшить потерю амниотической жидкости и последующую смертность плода.
Теперь, когда мы все подготовили, давайте рассмотрим основные шаги по электропорации мозговой ткани у развивающихся грызунов. Начните с обезболивания беременной матери с использованием 5% изофлурана, а затем перенесите его в респираторную трубку, доставляя 2,25% изофлуран на протяжении всей процедуры. Затем, для облегчения послеоперационной боли, подкожно введите анальгетик, такой как бупренорфин. Затем побрейте живот и простерилизуйте место разреза.
Чтобы хирургическим путем обнажить матку, сделайте вертикальный разрез по средней линии на коже и с помощью ножниц прорежьте брюшину. Чтобы зародыши не пересохли, накройте отверстие стерильной марлей, пропитанной солевым раствором. Далее аккуратно вытяните эмбриональную цепочку из брюшной полости, убедившись, что эмбрионы остаются влажными, накрыв стерильным предварительно подогретым физиологическим раствором.
С помощью диссекционного микроскопа определите эмбрионы, расположенные в правильном положении для легкого доступа к мозгу. С помощью пальцев или щипцов стабилизируйте головку эмбриона и введите раствор ДНК через стенку матки в мозг. Поместите электроды с каждой стороны головы положительным электродом в направлении, в котором вы хотите электропорировать ДНК. После того, как все правильно расположенные эмбрионы будут подвергнуты электропоре, осторожно поместите маточный рог обратно в брюшную полость.
Перед закрытием разреза добавьте в полость 2 – 3 мл теплого физраствора. Сшейте брюшину рассасывающимися швами, затем закройте кожу скобами. Наконец, перенесите мышь в клетку с грелкой и монитором.
Теперь, когда мы рассмотрели, как проводить внутриутробную электропорацию, давайте рассмотрим некоторые последующие применения этого метода.
Внутриутробная электропорация является полезным инструментом для изучения того, как определенные гены способствуют развитию нейронов. Электропорированные конструкции могут управлять сверхэкспрессией белков дикого типа или мутантных белков или полностью блокировать экспрессию белков. Неврологические фенотипы могут быть оценены либо на микроскопическом, либо на организменном уровне. Например, эти экспериментаторы определили, что временная сверхэкспрессия гена, связанного с шизофренией, DISC-1 в развивающемся мозге мышей, приводит к гиперчувствительности к амфетамину в более позднем возрасте.
Внутриутробная электропорация также может быть полезна для визуализации конкретных клеточных популяций и связей, которые они создают, доставляя последовательности, кодирующие флуоресцентные белки, в нервную ткань. Например, эти экспериментаторы электропорировали ген зеленого флуоресцентного белка в сетчатку E13.5 для изучения ганглиозных клеток сетчатки, или РГК, которые передают визуальную информацию от глаза к мозгу. Исследование сетчатки на уровне E18.5 показывает, как с помощью этой методики можно проследить путь аксона RGC через зрительный нерв, зрительный хиазму и зрительный тракт.
Наконец, многие важные события в развитии нервной системы происходят после рождения, вдохновляя ученых на разработку модифицированной методики, называемой электропорацией in vivo. Эта процедура следует тем же основным этапам, что и при внутриутробной электропорации, но обычно она выполняется в течение первых нескольких дней после рождения. Постнатальные генетические манипуляции особенно полезны для изучения более поздних типов клеток, таких как те, которые обнаружены в обонятельной луковице, показанной здесь.
Вы только что посмотрели видео JoVE о внутриутробной электропорации. В этом видео содержались ключевые принципы и общий обзор того, как проводить внутриутробную электропорацию, а также несколько последующих приложений, которые позволяют исследователям исследовать молекулярные механизмы, управляющие развитием нервной системы.
Спасибо за просмотр!
Внутриутробная электропорация является ключевым методом изучения молекулярных механизмов, которые управляют развитием нервной системы. Вводя ДНК для изменения экспрессии генов в определенных областях мозга развивающихся грызунов, исследователи могут изучать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и созревание нервных клеток в контексте их естественной среды.
В этом видео будут представлены ключевые принципы внутриутробной электропорации, общий обзор того, как выполнять эту технику, и ее применение в исследованиях в области нейробиологии.
Прежде чем мы углубимся в то, как выполнять эту процедуру, давайте сначала рассмотрим некоторые принципы электропорации. В этой процедуре используются электрические импульсы, которые создают переходные поры в клеточных мембранах, позволяя ДНК проникать в клетку. Поскольку отрицательно заряженная ДНК будет двигаться к положительному электроду, в зависимости от положения электрического поля можно воздействовать на различные клеточные популяции.
Хотя электропорация традиционно использовалась в исследованиях in vitro, научные достижения расширили ее использование на интактные органы, в том числе те, которые были обнаружены в эмбрионах мышей, развивающихся в утробе матери.
Внутриутробная электропорация, в отличие от клеточных культур или методов ex vivo, имеет то преимущество, что трансфицированные клетки будут продолжать подвергаться воздействию всех физиологических сигналов, которые управляют нормальным развитием. Это особенно важно для мозга, где такие структуры, как аксоны, нуждаются в направляющих сигналах от других типов клеток для правильного развития.
Развитие мозга, в частности, включает в себя запрограммированную серию событий пролиферации и миграции, а это означает, что различные слои тканей могут быть нацелены на основе времени электропорации.
Наконец, доступность различных типов электродов позволяет исследователям получить доступ как к областям у поверхности мозга, так и к более глубоким областям. Лопастные электроды используются при нацеливании на поверхностные части мозга, такие как кора головного мозга и гиппокамп, в то время как игольчатые электроды меньшего размера используются при нацеливании на глубокие структуры, такие как таламус и гипоталамус.
Теперь, когда мы обсудили некоторые основные принципы этой техники, давайте разберемся с подготовкой, чтобы углубиться в хирургическую процедуру и внутриутробную электропорацию.
Сначала простерилизуйте все инструменты и протрите операционную область 70% этанолом. Затем сделайте раствор для инъекций, растворив плазмидную ДНК в стерильном PBS, содержащем 0,1% Fast Green. Fast Green добавляется для визуализации раствора для инъекций в эмбрионе. Наконец, с помощью иглосъемника необходимо создать ультратонкую иглу, чтобы уменьшить потерю амниотической жидкости и последующую смертность плода.
Теперь, когда мы все подготовили, давайте рассмотрим основные шаги по электропорации мозговой ткани у развивающихся грызунов. Начните с обезболивания беременной матери с использованием 5% изофлурана, а затем перенесите его в респираторную трубку, доставляя 2,25% изофлуран на протяжении всей процедуры. Затем, для облегчения послеоперационной боли, подкожно введите анальгетик, такой как бупренорфин. Затем побрейте живот и простерилизуйте место разреза.
Чтобы хирургическим путем обнажить матку, сделайте вертикальный разрез по средней линии на коже и с помощью ножниц прорежьте брюшину. Чтобы зародыши не пересохли, накройте отверстие стерильной марлей, пропитанной солевым раствором. Далее аккуратно вытяните эмбриональную цепочку из брюшной полости, убедившись, что эмбрионы остаются влажными, накрыв стерильным предварительно подогретым физиологическим раствором.
С помощью диссекционного микроскопа определите эмбрионы, расположенные в правильном положении для легкого доступа к мозгу. С помощью пальцев или щипцов стабилизируйте головку эмбриона и введите раствор ДНК через стенку матки в мозг. Поместите электроды с каждой стороны головы положительным электродом в направлении, в котором вы хотите электропорировать ДНК. После того, как все правильно расположенные эмбрионы будут подвергнуты электропоре, осторожно поместите маточный рог обратно в брюшную полость.
Перед закрытием разреза добавьте в полость 2 – 3 мл теплого физраствора. Сшейте брюшину рассасывающимися швами, затем закройте кожу скобами. Наконец, перенесите мышь в клетку с грелкой и монитором.
Теперь, когда мы рассмотрели, как проводить внутриутробную электропорацию, давайте рассмотрим некоторые последующие применения этого метода.
Внутриутробная электропорация является полезным инструментом для изучения того, как определенные гены способствуют развитию нейронов. Электропорированные конструкции могут управлять сверхэкспрессией белков дикого типа или мутантных белков или полностью блокировать экспрессию белков. Неврологические фенотипы могут быть оценены либо на микроскопическом, либо на организменном уровне. Например, эти экспериментаторы определили, что временная сверхэкспрессия гена, связанного с шизофренией, DISC-1 в развивающемся мозге мышей, приводит к гиперчувствительности к амфетамину в более позднем возрасте.
Внутриутробная электропорация также может быть полезна для визуализации конкретных клеточных популяций и связей, которые они создают, доставляя последовательности, кодирующие флуоресцентные белки, в нервную ткань. Например, эти экспериментаторы электропорировали ген зеленого флуоресцентного белка в сетчатку E13.5 для изучения ганглиозных клеток сетчатки, или РГК, которые передают визуальную информацию от глаза к мозгу. Исследование сетчатки на уровне E18.5 показывает, как с помощью этой методики можно проследить путь аксона RGC через зрительный нерв, зрительный хиазму и зрительный тракт.
Наконец, многие важные события в развитии нервной системы происходят после рождения, вдохновляя ученых на разработку модифицированной методики, называемой электропорацией in vivo. Эта процедура следует тем же основным этапам, что и при внутриутробной электропорации, но обычно она выполняется в течение первых нескольких дней после рождения. Постнатальные генетические манипуляции особенно полезны для изучения более поздних типов клеток, таких как те, которые обнаружены в обонятельной луковице, показанной здесь.
Вы только что посмотрели видео JoVE об внутриутробной электропорации. В этом видео содержались ключевые принципы и общий обзор того, как проводить внутриутробную электропорацию, а также несколько последующих приложений, которые позволяют исследователям исследовать молекулярные механизмы, управляющие развитием нервной системы.
Спасибо за просмотр!
Related Videos
09:16
Neuroscience
96.7K Просмотры
09:43
Neuroscience
96.8K Просмотры
08:43
Neuroscience
96.0K Просмотры
10:15
Neuroscience
63.4K Просмотры
08:28
Neuroscience
152.2K Просмотры
08:55
Neuroscience
158.8K Просмотры
08:45
Neuroscience
47.3K Просмотры
07:42
Neuroscience
52.9K Просмотры
09:15
Neuroscience
59.4K Просмотры
11:25
Neuroscience
73.0K Просмотры
08:43
Neuroscience
68.0K Просмотры
08:04
Neuroscience
16.4K Просмотры
07:45
Neuroscience
23.5K Просмотры
09:24
Neuroscience
40.0K Просмотры