Электропорация in utero у мышей

Электропорация in utero является ключевым методом изучения молекулярных механизмов, управляющих нейроразвитием. Путем введения ДНК для изменения экспрессии генов в конкретных областях развивающегося мозга грызунов исследователи могут изучать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и созревание нейрональных клеток в условиях их естественной среды.

В данном видео будут представлены основные принципы электропорации in utero, общий обзор выполнения данной методики, а также области ее применения в нейробиологических исследованиях.

Прежде чем подробно рассмотреть выполнение данной процедуры, разберем основные принципы электропорации. В этом методе используются электрические импульсы, которые создают временные поры в клеточных мембранах, обеспечивая проникновение ДНК в клетку. Поскольку отрицательно заряженная ДНК перемещается к положительному электроду, воздействие на различные популяции клеток можно осуществлять в зависимости от ориентации электрического поля.

Хотя электропорация традиционно использовалась в in vitro исследования, научные достижения расширили область его применения до целых органов, включая органы развивающихся эмбрионов мыши in utero.

Электропорация in utero, в отличие от культур клеток или ex vivo методики обладают преимуществом, заключающимся в том, что трансфецированные клетки продолжают подвергаться воздействию всех физиологических стимулов, которые направляют нормальное развитие. Это особенно важно для головного мозга, где такие структуры, как аксоны, нуждаются в сигналах наведения от других типов клеток для правильного развития.

Развитие мозга, в частности, включает в себя программную серию событий пролиферации и миграции, что позволяет воздействовать на различные слои ткани в зависимости от времени проведения электропорации.

Наконец, наличие различных типов электродов позволяет исследователям воздействовать как на области, расположенные близко к поверхности мозга, так и на более глубокие структуры. Лопастные электроды используются при воздействии на поверхностные части мозга, такие как кора и гиппокамп, в то время как более мелкие игольчатые электроды применяются для воздействия на глубокие структуры, например, на таламус и гипоталамус.

Теперь, когда мы обсудили основные принципы метода, перейдем к подготовке, чтобы мы могли подробно рассмотреть хирургическую процедуру и электропорацию in utero.

Сначала стерилизуйте все инструменты и протрите рабочую область 70% этанолом. Затем приготовьте раствор для инъекций, растворив плазмидную ДНК в стерильном PBS, содержащем 0,1% Fast Green. Fast Green добавляется для визуализации раствора для инъекций в эмбрионе. Наконец, с помощью прибора для вытягивания игл необходимо изготовить ультратонкую иглу, чтобы уменьшить потерю амниотической жидкости и последующую гибель плода.

Теперь, когда все подготовлено, разберем основные этапы электропорации тканей мозга развивающихся грызунов. Начните с анестезии беременной самки с использованием 5% изофлурана, затем переведите ее на респираторную трубку, подающую 2,25% изофлурана на протяжении всей процедуры. Далее, для послеоперационного обезболивания, подкожно введите анальгетик, например, бупренорфин. Затем выбрейте шерсть на животе и стерилизуйте место разреза.

Чтобы хирургически обнажить матку, сделайте вертикальный разрез кожи по срединной линии и с помощью ножниц рассеките брюшину. Чтобы предотвратить высыхание эмбрионов, закройте отверстие марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе. Затем аккуратно извлеките цепочку эмбрионов из брюшной полости, стараясь поддерживать их во влажном состоянии, накрывая стерильным предварительно подогретым физиологическим раствором.

С помощью диссекционного микроскопа выберите эмбрионов, положение которых обеспечивает удобный доступ к мозгу. Пальцами или пинцетом зафиксируйте голову эмбриона и введите раствор ДНК через стенку матки в мозг. Разместите электроды по обе стороны головы, при этом положительный электрод должен быть направлен в сторону, в которую необходимо перенести ДНК при электропорации. После проведения электропорации всех подходящих по положению эмбрионов осторожно верните рог матки в брюшную полость.

Перед зашиванием разреза введите в полость 2–3 ml теплого физиологического раствора. Сшейте брюшину рассасывающимися швами, затем закройте кожу с помощью скоб. В завершение перенесите мышь в клетку с грелкой и проведите мониторинг состояния.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуру электропорации in utero, давайте изучим некоторые варианты применения этого метода в дальнейших исследованиях.

Электропорация in utero является полезным инструментом для изучения того, как конкретные гены влияют на развитие нервной системы. Электропорированные конструкции могут обеспечивать гиперэкспрессию белков дикого типа или мутантных белков, либо полностью блокировать экспрессию белков. После этого неврологические фенотипы можно оценить как на микроскопическом, так и на организменном уровне. Например, данные исследователи установили, что транзиторная гиперэкспрессия гена DISC-1, связанного с шизофренией, в развивающемся мозге мыши приводила к гиперчувствительности к амфетамину в более позднем возрасте.

Электропорация in utero также может быть полезна для визуализации конкретных популяций клеток и их связей путем доставки в нервную ткань последовательностей, кодирующих флуоресцентные белки. Например, эти исследователи ввели с помощью электропорации ген зеленого флуоресцентного белка в сетчатку на стадии E13.5 для изучения ганглиозных клеток сетчатки (RGCs), которые передают зрительную информацию от глаза в мозг. Исследование сетчатки на стадии E18.5 показывает, как этот метод может быть использован для отслеживания пути аксона RGC через зрительный нерв, зрительный перекрест и зрительный тракт.

Наконец, многие важные события в развитии нервной системы происходят после рождения, что побудило ученых разработать модифицированный метод, называемый электропорацией in vivo. Эта процедура включает те же основные этапы, что и электропорация in utero, но обычно проводится в течение первых нескольких дней после рождения. Постнатальные генетические манипуляции особенно полезны для изучения типов клеток, которые появляются на более поздних стадиях, таких как клетки в обонятельной луковице, показанной здесь.

Вы только что посмотрели видео JoVE по электропорации in utero. В этом видео были представлены основные принципы и общий обзор метода проведения электропорации in utero, а также несколько последующих приложений, которые позволяют исследователям изучать молекулярные механизмы, управляющие нейроразвитием.

Спасибо за просмотр!