Отбор проб почвы и изоляция энтомопатогенных нематод (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Целью данной процедуры является демонстрация методов и приемов, обычно используемых для отбора проб почвы и выделения энтеропатогенных нематод. Это достигается путем предварительного сбора образцов почвы с помощью трансектационного подхода или, как было продемонстрировано, путем случайного отбора проб. Далее образцы почвы утилизируют насекомыми для выборочного восстановления энтеропатогенных нематод

Завершающим этапом является сбор нематод от зараженных насекомых с помощью модифицированной белой ловушки. В конечном счете, эти методы представляют собой ключевые шаги для успешного создания культур энтеропатогенных нематод в лаборатории и формируют основу для последующих биотестов. Преимущество методики отбора проб почвы в том, что мы можем выехать в поле и собрать зрелые стадии патогенных нематод

Я предпочитаю отбирать насекомых, зараженных этой нематодой, с которыми редко встречаются. Используемая нами стратегия случайной выборки обычно используется для оценки разнообразия патогенных нематод из большого географического региона или области. Впервые эта методика была описана в ставках в Accur в 1975 году.

Это селективная процедура, основанная на предпосылке, что свободные стадии жизни будут притягиваться к насекомым-хозяевам и паразитировать на них. Демонстрировать процедуры будут аспирант Рю Ороско и техник-исследователь Мин Мингл в моей лаборатории. Лаборатория. Площадка для сбора проб должна иметь минимальную площадь в два квадратных метра, а по возможности и быть больше четырех квадратных метров.

Для каждого образца почвы возьмите по крайней мере три меньших подобразца в пределах участка образца DM a C. Подвыборки могут быть объединены, если это соответствует целям исследования. Собирают образцы почвы на глубину от нуля до 15 сантиметров.

Каждый образец должен составлять от 250 грамм до одного килограмма. Используйте почвенные CORA, троусы, ручные лопаты или аналогичные инструменты и собирайте как минимум с пяти случайных участков в каждой выбранной области отбора проб. Каждый образец должен быть упакован в двойную упаковку и помечен водостойким маркером.

Этикетка должна содержать информацию об участке, местоположении, высоте, дате и переменных окружающей среды, таких как описание среды обитания с соответствующей растительностью и температурой на участке. Обратите внимание на местных насекомых и другие виды беспозвоночных. Соберите виды, которые не могут быть сразу идентифицированы, для последующей идентификации в лаборатории между местами сбора тщательно промойте инструменты для сбора водой, затем продезинфицируйте их с помощью 70% этанола или 0,5% отбеливателя.

Храните образцы почвы в холодильнике при температуре от восьми до 15 градусов Цельсия для транспортировки. CES отделяет одну часть образца для анализа общих характеристик почвы, таких как ее состав, текстура, проводимость и так далее. Из каждого образца почвы удалите мусор, который может привести к загрязнению сейк-микробами.

Затем увлажните почву водой, чтобы находящиеся в ней нематоды могли легко передвигаться. Загрузите от 200 до 250 граммов влажной почвы в пластиковый контейнер с крышкой. Затем добавьте приманки для насекомых.

Достаточно будет от пяти до 10 насекомых. Прикрепите крышку, переверните емкость и поставьте ее в темноту. При комнатной температуре каждые два-три дня удаляйте мертвых насекомых и по мере необходимости заменяйте их здоровыми насекомыми для дополнительного утяжеления.

Если труп насекомого коричневого цвета или охры, это говорит о том, что Штейн и Нема паразитируют на парите. В то же время, если труп имеет кирпично-красный или темно-фиолетовый цвет, ожидайте гетеро. Используйте модифицированную белую ловушку для сбора нематод, которые паразитировали на приманках насекомых.

Сначала поместите крышку 50 или 60-миллиметровой чашки Петри в основание 100-миллиметровой посуды. Затем выложите лист круглого ватмана. Фильтрующая бумага номер один в меньшей тарелке.

Промойте трупы насекомых стерилизованной водой и переложите их на фильтровальную бумагу. Разложите так, чтобы они не соприкасались друг с другом. Наполните только большую посуду примерно 20 миллилитрами дистиллированной воды и накройте сборку с более крупными блюдами. Крышка.

На посуде должны быть указаны название нематоды, дата и дата приманки насекомых. Ловушка установлена. Держите ловушки при комнатной температуре и следите за инфекционными, молодыми нематодами или IJ, выходящими из трупов насекомых.

Это может занять от 10 до 25 дней и зависит от температуры и уровня влажности в месте хранения ловушки. Если уровень воды в ловушке испарился, обязательно заправьте его на пластины с ИИ. Набирайте воду из более крупной посуды, в которой должны содержаться нематоды.

Дайте нематодам утонуть в течение нескольких минут, а затем медленно сцедите воду. Как только нематоды останутся в небольшом объеме воды, промойте их еще несколько раз, добавив обратно воды, а затем осторожно вылив ее. Затем проводят серийные разведения для оценки популяции нематод.

В колбе для культур объемом 250 миллилитров отрегулируйте концентрацию нематоды до 1-3000 нематод на миллилитр. Храните эту суспензию при температуре от 10 до 20 градусов Цельсия. Как правило, в природе шансы встретить насекомых, паразитирующих на энтеропатогенных нематодах, очень низки.

Таким образом, описанный протокол с использованием личинок G. melanoma в качестве приманки был использован для выделения таких нематод с гораздо более эффективной скоростью. Через пять дней насекомые были заражены и имели красную окраску. Модифицированные белые ловушки показали следы нематод.

Через 15 дней из этих ловушек нематоды собирались в воде, имели чистый вид и были свободны от тканей насекомых. Один цикл экстракции с использованием личинок галлиевой мелании может быть недостаточным для восстановления всех патогенных нематод Oma, которые находятся в образце почвы. Поэтому мы рекомендуем делать это несколько раз.

Кроме того, мы советуем пользователям рассмотреть других насекомых, а не Galleria, что также повысит шансы на восстановление. Обсуждение образцов почвы с насекомыми — это метод, который также может быть использован для изоляции других насекомых-патогенов, таких как бактерии или грибки.