1.13: Эксплантная культура нервной ткани

Эксплантные культуры служат методом исследования развития конкретных клеточных популяций и нервных структур. В экспериментах в области нейробиологии развития экспланты — это нервные ткани, вырезанные из эмбриона для продолжения развития in vitro. Эти культуры дают исследователям возможность манипулировать развивающимися тканями и визуализировать их способами, которые невозможны in vivo. В этом видео мы познакомим вас с некоторыми важными принципами работы с эксплантированными тканями, пошаговыми процедурами для двух подходов к культивированию эксплантов, а также с применением этой техники.

Прежде чем углубиться в методы, давайте пройдемся по некоторым основным принципам. Экспланты могут быть получены из ряда модельных организмов и различных типов тканей. Как правило, культуры создаются путем тщательного удаления нервной ткани из эмбриона, препарирования интересующей области и помещения ее в искусственную среду.

Ткани также могут быть разделены на тонкие листы и выращены в «культуре срезов». Поскольку культуральная среда спроектирована таким образом, чтобы имитировать условия in vivo всего органа, эту культуральную стратегию часто называют «органотипической».

Прежде чем начать, обязательно простерилизуйте инструменты с помощью этанола на 70%. Затем усыпьте беременную мышь, используя предпочтительный для вашей лаборатории метод. Затем хирургическим путем иссекают матку и помещают в ледяной буфер. Перенесите чашку в диссекционный микроскоп и извлеките отдельные эмбрионы из их желточного мешка. Затем изолируйте мозг, тщательно препарируйте интересующую вас область и перенесите в чашку с культурой, содержащую питательную среду. Экспланты могут содержаться в 37 ? C инкубатор, содержащий 5% CO2 в течение нескольких недель, заменяя 50% среды каждые 2 - 3 дня.

Срез культуры мозговой ткани требует нескольких дополнительных шагов. Перед срезом ткань погружается в агарозу, которая обеспечивает поддержку ткани, поэтому она остается неповрежденной во время разрезания. Для этого нагревают 1,5%-ный раствор агарозы с низкой температурой плавления до полного растворения агарозы. Далее агарозу перекладывают в закладные формы и дают немного остыть, чтобы не повредить ткань.

Затем ткань можно осторожно погрузить, а агарозу оставить затвердевать. Полученные блоки обрезаются, а затем приклеиваются к сцене образца и разрезаются с помощью вибратома, который представляет собой инструмент, использующий вибрирующее лезвие для резки тонких ломтиков живой ткани. По мере получения срезов их осторожно переносят на покрытую покрытием пластину, содержащую питательные среды, и культивируют, как упоминалось ранее.

Существует ряд преимуществ использования эксплантных культур по сравнению с in vivo и другими методами in vitro. Во-первых, клетки в эксплантированных тканях более доступны для экспериментальных инструментов. Во-вторых, тот факт, что экспланты поддерживают сложную клеточную архитектуру развивающейся нервной ткани, означает, что межклеточные взаимодействия могут быть изучены. В-третьих, поскольку они могут контролировать химический состав питательной среды, ученые могут использовать экспланты для проверки влияния конкретных соединений на развитие тканей.

Тем не менее, поскольку он удаляется из естественной среды, необходимо проявлять особую осторожность для поддержания счастливой и здоровой ткани in vitro. Например, наличие внеклеточного матрикса, или ВКМ, оказывает существенное влияние на поведение клеток, поэтому очищенные белки ВКМ часто используются для покрытия культуральных чашек. Еще одним важным фактором является раствор, в котором купаются экспланты. В то время как традиционные среды для клеточных культур часто используются, некоторые эксперименты требуют решений, которые очень похожи на жидкость, циркулирующую в центральной нервной системе: спинномозговую жидкость, которая является критически важным реагентом в экспериментах, подобных тем, которые вы сейчас увидите.

Теперь, когда мы рассмотрели методы культивирования эксплантов, давайте посмотрим, как эти методы используются.

В анализах миграции клеток используется эксплантированная ткань для изучения отталкивающих и притягивающих сигналов, которые участвуют в движении нервных клеток. В этом эксперименте бусины, которые ранее были пропитаны факторами роста, имплантируются в экспланты заднего мозга для изучения миграции нервных клеток. Через 3 - 4 дня воздействия нейроны визуализировали с помощью конфокального микроскопа. Результаты показывают, что моторные нейроны мигрируют к шарикам, пропитанным фактором роста эндотелия сосудов, но не контролируют шарики, пропитанные буфером.

Ко-культуральные анализы часто используются для изучения межклеточных взаимодействий во время развития. В этом примере сегменты спинного мозга были культивированы поверх слоя мышечных клеток, чтобы изучить, как создаются связи между спинальными двигательными нейронами и скелетными мышцами. Уже через 2 дня после инкубации видно, как из экспланта выходят проекции от нейронов, также известные как нейриты. В течение 5 дней наблюдается функциональная иннервация за счет сокращения слоя мышечных клеток.

Во время развития нервной системы нейроны должны удлинять свои аксоны, чтобы установить связь между целевой тканью и центральной нервной системой. Одним из способов изучения этого сложного процесса является анализ с помощью наведения аксонов. Исследователи используют эксплантированные ткани для изучения факторов внутри нейронов и в окружающей среде, которые помогают направить аксон к его надлежащему местоположению.

Вы только что посмотрели руководство JoVE по культуре эксплантов нервной ткани. В этом видео был представлен обзор преимуществ культур эксплантов, стратегий культивирования, пошаговых протоколов двух часто используемых процедур экспланта и способов использования этих методов в лаборатории сегодня.

Спасибо за просмотр!