Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов

Общая цель этой процедуры — составить карту взаимодействия между двумя белками или белковыми доменами. В этом случае изучаются связанные с раком белковые домены и CHFR. Общая цель этой процедуры — составить карту взаимодействия между двумя белками или белковыми доменами.

В этом случае изучаются связанные с раком белковые домены и CHFR. Второй шаг заключается в инкубации пептидной матрицы CHFR с ее партнером по связыванию, неподвижным белком. Далее массив промывают и инкубируют с пероксидазой хрена, конъюгированным антителом.

Затем матрица подвергается химическому детектированию люминесценции для обнаружения связывания. Заключительным этапом является анализ результатов и выявление сайтов связывания между белками. Это исследование открывает путь к разработке рациональных ингибиторов связывания неподвижных CHFR, неконтролируемое взаимодействие которых может привести к развитию рака.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследовании белкового взаимодействия, такие как какие конкретные области медитируют на взаимодействие между двумя белками, Разделить последовательность целевого белка на 10-20 остаточных пептидов. Это частично пересекается. Количество перекрытий может быть разным, но в принципе, чем длиннее перекрытие, тем лучше.

При проектировании пептидов учитывают известные элементы вторичной структуры в белке, которые могут отвечать за взаимодействие. Разработанный пептидный массив можно заказать у коммерческих поставщиков. В этом эксперименте пептиды из остатков домена CHFR с 4 24 по 6 62 ковалентно связываются с матрицей через С-конец.

Получив спроектированный массив, подготовьте его к эксперименту, предварительно заблокировав его, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Сделайте блокирующее решение из расчета 2,5% веса на объем. Сухое обезжиренное молоко в буферном растворе триса, содержащем 0,05% Tween 20 или TBST для предотвращения неспецифического связывания.

Погрузите массив в пять миллилитров блокирующего раствора. Инкубируйте массив в течение двух-четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на шейкере. Сначала промойте массив пятью миллилитрами блокирующего раствора в течение 30 секунд.

Затем дважды промойте массив пятью миллилитрами TBST в течение пяти минут на шейкере при комнатной температуре. Затем инкубируйте промытую матрицу с пятью миллилитрами белкового раствора, меченного полигистидином, содержащим 2,5% веса на объем. Обезжиривайте сухое молоко, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.

Здесь используется 4,5 микромолярный раствор неподвижных белковых остатков от 500 до шести 50. Затем инкубируйте массив в белковом растворе в течение трех-восьми часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Последующая инкубация в белковом растворе.

Промойте массив пятью миллилитрами TBST в течение 30 секунд на шейкере при комнатной температуре, после чего последует еще два пятиминутных промывания. Теперь инкубируйте промытую матрицу с пятью миллилитрами разведенного конъюгированного антитела к пероксидазе хрена в инкубационном буфере, который содержит те же ингредиенты в тех же концентрациях, что и блокирующий раствор, в течение одного часа на шейкере при комнатной температуре, антитело может связываться либо с белком-мишенью, либо с меткой, проведите контрольные эксперименты, проверяя взаимодействие антитела с пептидами на матрице путем повторения того же протокола на отдельной матрице. Слайд без инкубации с белком перед считыванием массивов. Вымойте их, как и раньше, пятью миллилитрами TBST.

Проведите разработку хемилюминесценции с помощью расширенного набора хемилюминесцентного вестерн-блоттинг-субстрата. Выполните обнаружение с помощью люминесцентного анализатора изображений, такого как пленочная камера Fuji LAS 3000. Проанализируйте результаты, убедившись, что оба дубликата на массиве показывают одни и те же сигналы, поэтому результаты надежны.

Если структура белкового партнера известна, выполните поиск связывающих пептидов в структуре и ищите места связывания. Имейте в виду, что пептиды, находящиеся далеко в последовательности, могут находиться вместе в третичной структуре и образовывать сайт связывания. В нашем примере очень важный белок Centro Somal, который контролирует нормальное деление и пролиферацию клеток, все еще взаимодействует с несколькими белками через свою внутренне неупорядоченную область.

С помощью разработанной пептидной матрицы были выявлены неподвижные сайты связывания в опухолевом супрессоре CHFR. Каждое черное пятно в массиве представляет собой производный пептид A-C-H-F-R, который должен отметить, что каждый пептид появляется дважды, поскольку он существует в двойном экземпляре, что подтверждает надежность результатов. Скрининг пептидной матрицы выявил семь пептидов, полученных из CHFR, которые связываются с все еще внутренне неупорядоченной областью остатков от 500 до шести 50.

Эти результаты позволили нам составить карту места связывания неподвижного камня на CHFR. Несмотря на расстояние этих семи пептидов по первичной последовательности CHFR. Они создают четко определенный сайт связывания для неподвижного газа в третичной структуре CHFR.

Этот метод применим для характеристики каждого белкового взаимодействия после этой процедуры. Количественные методы, такие как флуоресценция и изотоп или ITC, должны использоваться для верификации и количественной оценки поступления пептидов.