Очищение нечистых: секвенирование метагеномов и Metatranscriptomes от сложных образцов животного связано

Общая цель этой процедуры заключается в сборе и обработке сложных образцов, связанных с хозяином, таких как мокрота муковисцидоза, для изучения вирусных и микробных сообществ с использованием метагеномных и метатранскриптомных подходов. Это достигается путем вдыхания 7% гипертонического раствора с помощью небулайзера, а затем сбора образцов индуцированной мокроты в течение 30 минут. Затем образец немедленно гомогенизируется и равномерно распределяется по четырем пробиркам, помеченным как вирусный метагеном, микробный метагеном, метатранскриптом и дополнительная мокрота.

Затем мета-транскриптомную трубку запечатывают, помещают горизонтально и гомогенизируют мокроту со средней скоростью в течение 10 минут. Наконец, отдельные аликвоты обрабатываются отдельно для выделения и очистки вирусных или бактериальных клеток перед выделением нуклеиновых кислот для метагеномных исследований. В конечном счете, выделенные нуклеиновые кислоты используются для высокопроизводительной подготовки библиотек секвенирования для создания библиотек метагеномики и метатранскриптомики.

Основное преимущество этой процедуры заключается в том, что она обеспечивает комплексный рабочий процесс обработки сложного образца, ассоциированного с хозяином, для изучения вирусных и бактериальных сообществ на уровне ДНК и РНК. Визуальная демонстрация этой процедуры имеет решающее значение, поскольку этапы предварительной обработки образца важны для обеспечения надлежащего обращения с образцом, в то время как этапы очистки вирусных и микробных клеток трудно изучить из-за сложности процедуры Перед сбором образца пометьте четыре пробирки по 15 миллилитров на образец следующим, первая из которых содержит вирусный метагеном. второй в виде микробного метагенома номер три с метатранскриптомом и трубка номер четыре в виде дополнительной мокроты. Добавьте два миллилитра 0,1 миллиметра кремнеземных шариков в пробирку, помеченную мета-транскриптомом, а затем шесть миллилитров буфера для лизиса РНК на основе изотиоцианата гина, или буфера для лизиса GITC.

Следуя процедуре сбора проб, описанной в текстовом протоколе, и используя предварительно отобранные пробы, оцените объем пробы, взвешивая чашку после сбора пробы, и вычтите вес пустой чашки. Для оставшегося веса один грамм будет эквивалентен одному миллилитру пробы. Если объем пробы меньше восьми миллилитров, добавьте соответствующий объем 0,02 микрометра к отфильтрованному одному XPBS, чтобы довести итоговый объем до восьми миллилитров.

Затем с помощью трехмиллилитрового шприца гомогенизируйте образец до тех пор, пока в мокроте не останется видимых комков, используя тот же шприц, немедленно наберите два миллилитра мокроты и введите ее в микротранскриптомную пробирку, содержащую гранулы диоксида кремния и буфер для лизиса GITC. Закройте крышку и используйте пара-пленку, чтобы надежно закрыть крышку Чтобы избежать утечки, используйте вихревую пленку, сэр, чтобы немедленно гомогенизировать мокроту со средней скоростью в течение 10 минут. С помощью того же шприца аликвоту, по два миллилитра мокроты в пробирки, помеченные виральным метагеномом и микробным метагеномом, и перенести оставшуюся мокроту из стаканчика мокроты в пробирку, помеченную дополнительной мокротой.

Храните все пробирки при температуре четыре градуса Цельсия или на льду и при необходимости транспортируйте в лабораторию для создания вирусного метагенома. После этого приготовлены буферы и растворы. Предварительно обработайте образцы, добавив 0,02 микрометра отфильтрованного солевого магниевого буфера до общего объема шесть миллилитров.

Чтобы ускорить растворение слизи, добавьте шесть миллилитров 6,5 миллимоларов DTT в каждый образец. Вихрь энергично перемешать и инкубировать в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия. После энергичного вортекса образцы снова вращаются при 3056 G и 10 градусах Цельсия в течение 15-20 минут.

Соберите каждую надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую трубку. Далее с помощью точечного фильтра 45 микрометров, установленного на шприце, отфильтруйте надосадочную жидкость в новые 15-миллилитровые пробирки. Извлеките 100 микролитров образца в микрофуговую пробирку, а затем проведите обработку хлороформом.

Извлеките надосадочную жидкость и проведите обработку DN one. Добавьте равный объем 4%парапары формальдегида для фиксации образца. Для эпифлуоресцентной микроскопии обратитесь к текстовому протоколу для универсального подхода к обогащению вирусными частицами.

В противном случае, используя свежеприготовленные растворы хлорида цезия, установите градиент хлорида цезия, загрузив в каждую пробирку один миллилитр 1,7 грамма на миллилитр раствора хлорида цезия, затем один миллилитр 1,5 грамма на миллилитр, один миллилитр одной точки 35 граммов на миллилитр и, наконец, один миллилитр 1,2 грамма на миллилитр раствора хлорида цезия. Наконец, загрузите от шести до восьми миллилитров образца в отдельные градиентные пробирки. Отметьте отдельные слои, чтобы обозначить расположение каждой дроби.

Затем уравновесьте каждую противоположную пару двоек с точностью до одного миллиграмма. Аккуратно зафиксируйте каждую трубку в вращающемся ведре. Загрузите на ротор и центрифугу при давлении 82, 844 G и четырех градусах Цельсия в течение двух часов.

После центрифугирования осторожно извлеките пробирки из держателя, не нарушая градиентов плотности, с помощью иглы 18 калибра, прикрепленной к трехмиллилитровому шприцу. Убедитесь, что открытый конец иглы направлен вверх. Проткните трубку чуть ниже слоя плотности 1,5 грамма на миллилитр и медленно наберите в шприц примерно 1,5 миллилитра раствора.

Медленно извлеките иглу и дайте оставшейся фракции в пробирке капнуть в новую 15-миллилитровую трубку через прокол. Обозначьте это как верхняя часть талии Перелейте раствор из шприца, содержащего Vps, в две новые микропробирки. После того, как буферы и растворы будут приготовлены, в соответствии с текстовым протоколом, добавьте пять объемов точки 22 микрометра, отфильтрованного одним XPBS Чтобы разбавить каждый гомогенат под химическим колпаком, добавьте бета-метанол MAR capta до конечной концентрации 2% объема к объему и взбалтывайте смесь при комнатной температуре в течение двух часов после инкубации.

Вращайте образец при температуре 3056 GS и 10 градусах Цельсия в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости используйте 10 миллилитров молекулярной воды для ресуспендирования гранулы и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут, прежде чем повторить промывку. После последнего отжима и после того, как натин SUP будет отброшен, используйте пять миллилитров одного буфера XDNA для ресуспендирования гранулы, прежде чем добавлять 15 микролитров ds.

Один на миллилитр образца Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с повторным перемешиванием в течение двух часов. После отжима образцов и отбрасывания сната используйте 10 миллилитров буфера SE для ресуспендирования гранулы. Затем закрутите образец и повторите промывку.

Используйте два миллилитра буфера SE для ресуспендирования гранулы и перенесите суспензию в две микропробирки. Затем вращайте трубки при температуре 16 000 GS при комнатной температуре в течение 15 минут. Наконец, после удаления надосадочной жидкости используйте набор для экстракции геномной ДНК, следуя инструкциям для грамположительных бактерий.

Для выделения ДНК здесь обобщены предыдущие результаты генерации вирусных метагеномов. Виромы содержат мало последовательностей, полученных от человека, и только один образец содержит 70% ДНК человека. CCF 4 A был исключен из стадии ультрацентрифугирования с градиентом плотности, и в результате он содержал более 97% последовательностей, полученных от человека. На этом рисунке показано флуоресцентное изображение типичного образца мокроты CF до и после ультрацентрифугирования с градиентом плотности.

Прозрачные vlp наблюдались в отсутствие крупных частиц после разделения градиента плотности, как показано здесь. Семь ежедневных образцов мокроты были собраны у одного пациента с муковисцидозом, который начал пероральный прием антибиотиков. После третьего дня сбора общий выход гипотонического лизиса или ДНК HL, собранной из каждого образца, варьировался от 210 нанограммов до более чем пяти микрограммов из библиотек секвенирования Illumina, сгенерированных для каждого образца.

Все библиотеки, кроме одной, дали более 1 миллиона последовательностей, и более 85% высококачественных последовательностей были сохранены после предварительной обработки данных. При использовании программного обеспечения print seq общее количество последовательностей, полученных от человека, варьировалось от 14% до 46%. Как показано здесь, микробные профили подобразцов очень похожи на образцы после двух процедур гипотонического лизиса. Кроме того, второй гипотонический лизис увеличивает долю нечеловеческих последовательностей на 6-17% в метагеномах.

Не забывайте, что работа с клиническими образцами и потенциальными патогенами может быть чрезвычайно опасной. Во время работы с пробами всегда следует использовать средства индивидуальной защиты. При выполнении этой процедуры требуются хорошие методы молекулярной биологии и микробиологии, чтобы гарантировать отсутствие загрязнения.

После этой процедуры вы должны быть в состоянии проводить вирусные и микробные метагеномные, а также метатранскриптомные исследования сложных образцов, таких как мокрота муковисцидоза.