Live-визуализация Drosophila Куколки глаз

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективный метод создания фильмов с изображением развития зрачка дрозофилы и глаза. Это достигается путем удаления О-образной завивки зрачка и разрыва вдоль боковой части, чтобы обнажить нейроэпителий одного глаза. Второй шаг заключается в сборке установки для визуализации и установке куколки на небольшую бусину вазелина.

Следующие серийные срезы нейроэпителия в области адгезионного пояса получают с помощью стандартного флуоресцентного микроскопа. Заключительным этапом является стабилизация отснятого материала и внесение корректировок цвета в стандартное программное обеспечение для редактирования изображений. В конечном счете, визуализация нейроэпителия дрозофилы в живых клетках используется для выяснения поведения клеток.

Визуальная демонстрация этого метода на глазу имеет решающее значение, так как частичное препарирование куколки и последующая правильная установка ее в установку для визуализации может быть сложной задачей, потому что щенки на этом этапе довольно хрупкие. Кроме того, правильная ориентация куколки и правильное размещение покровного стекла над эпителием глаза имеют решающее значение для успешной визуализации. Демонстрировать процедуру будет Марк Хеллерман из нашей лаборатории.

Чтобы начать эксперимент, выберите белые препуи из ранее скрещенных генотипов и поместите их в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Затем положите кусок ткани площадью 10 квадратных сантиметров, смоченный в дистиллированной воде, в чистую пластиковую коробку для наконечников. Вставьте пробирки микроцентрифуги в коробку для наконечника.

Влажная ткань предотвратит высыхание щенка, а затем инкубируется при температуре 25 градусов Цельсия в течение 17-25 часов. После инкубации поместите кусок свежего двустороннего скотча на черную форму для вскрытия сигар. Расположите куколку спинной стороной вверх на ленте и убедитесь, что голова куколки прикреплена к двусторонней ленте, не приклеивая грудную и брюшную части куколки.

С помощью щипцов осторожно поднимите и снимите А-образную завивку, чтобы обнажить головку зрачка. Далее разорвите вдоль боковой части корпус зрачка. Чтобы обнажить область вокруг одного глаза, аккуратно снимите зрачок с липкой ленты.

Соберите маленькую рамку площадью 15 квадратных миллиметров из промокательной бумаги и проделайте пятимиллиметровое отверстие посередине. Погрузите в рамку дистиллированную воду и поместите ее в центр микроскопа. Створите с помощью шприца объемом 30 куб. см.

Выдавите равномерное кольцо из вазелина, чтобы окружить рамку из промокательной бумаги. Далее добавьте небольшую капельку вазелина прямо на предметное стекло. Аккуратно положите куколку на бок и поддержите ее вазелином.

Сверху на кольцо из вазелина поместите защитный лист так, чтобы он соприкасался с эпителием над глазом. Аккуратно сожмите препарат, чтобы прижать покровное стекло к вазелину и создать небольшую плоскую контактную поверхность между областью зрачка глаза и изображением покровного стекла, препаратом зрачка. С помощью флуоресцентного микроскопа захватывайте серийные срезы через AAL-домен глаза, нейроэпителий в области адгезионного соединения каждые семь минут.

Используйте соответствующее программное обеспечение для деконволюции, чтобы уменьшить фон и повысить контрастность изображений последовательных разделов для каждого файла Zack и программного обеспечения L-A-S-A-F. Перейдите на панель инструментов. Выберите 3D деконволюцию и нажмите применить.

Создание максимальной проекции или MP-изображения для каждого файла со сложным стеком. Выровняйте каждое изображение MP, чтобы подчеркнуть поведение отдельных клеток и уменьшить отвлекающие факторы, вызванные ростом организма. С помощью встроенных алгоритмов в Photoshop CS five из файловой вкладки главного меню откройте скрипты и выберите загрузку файлов в стопку.

Затем импортируйте файлы изображений MP в панель слоев загрузки. Убедитесь, что опция «Попытка автоматического выравнивания исходных изображений» не выбрана. В противном случае данные изображения могут быть искажены.

После того, как все файлы MP будут загружены на панель слоев, убедитесь, что все изображения расположены в хронологическом порядке и что самая ранняя временная точка находится в верхней части слоя. Перетаскивайте их в стопку, пока они не будут упорядочены правильно. Если необходимо, выберите автоматическое выравнивание слоев.

Выберите «Переместить» и нажмите «ОК». Вне фокуса области исходного МП-изображения могут быть скорректированы для получения равномерно сфокусированного поля сетчатки. Чтобы начать обработку изображения, используйте функцию обрезки в LAS.

Saf вручную ограничивает начальный и конечный срезы, чтобы они охватывали только пояс адгезии в пределах первоначально не сфокусированной области. Нажмите кнопку «Применить», чтобы создать новый файл стека, оптимизированный для этой области. Затем сгенерируйте новую максимальную проекцию для локально оптимизированного стека и экспортируйте ее в виде файла TIF в Photoshop.

Откройте скрипты и выберите загрузку файлов в стек. Затем введите исходный MP-файл и оптимизированный MP-файл в панель загрузки слоев. Опять же, убедитесь, что параметр «Попытка автоматического выравнивания исходных изображений» не выбран, и нажмите «ОК».

Выделите оба слоя и выберите автоматическое наложение слоев, чтобы создать равномерно сфокусированное поле сетчатки. Сохраните это составное изображение в виде файла TIF. Используйте инструмент преобразования для поворота изображений таким образом, чтобы дорсальная вентральная ось сетчатки была выровнена по оси Y кадра фильма.

Используйте регулировку уровня отдельных кадров для усиления контраста между клеточной мембраной и телом клетки. Затем выберите «Создать кадры из слоев», чтобы преобразовать изображения в фильм. Обратите внимание, что слои добавляются на панель анимации в последовательном порядке, начиная с нижней части стека.

Чтобы изменить порядок стопок на обратный, выберите все кадры, а затем выберите обратные кадры. Выберите время задержки кадра 0,8 секунды для каждого кадра и выберите QuickTime. Экспортируйте и выберите нужный формат видео.

Наконец, в разделе «Параметры рендеринга» выберите пользовательскую частоту кадров и введите частоту кадров 15. Затем нажмите кнопку рендеринга. С помощью этой техники наблюдался выраженный градиент развития по всему глазу, что послужило поводом для подробного описания паттернов глаз.

Во время первичного обертывания две клетки были задействованы в качестве первичных, которые быстро окружили пучки фоторецепторов, соединяющиеся друг с другом, образуя стабильные соединения. Недифференцированные клетки интероматериала лежали в неорганизованном порядке, когда первичные обмотки были завернуты и запечатаны. В каждом пучке фоторецепторов происходит реорганизация локальных движений клеток.

Внутренние клетки сгруппированы на дорсальной и вентральной сторонах каждой омы. Интеркаляция между ячейками переставляла ячейки из двух строк в одну строку. После интеркаляции третичная конкуренция была зафиксирована под микроскопом.

Конкурирующие клетки занимали третичную нишу в течение 5-10 минут до вытеснения. В конце концов, одна клетка создала стабильную третичную нишу. Во время окончательной обрезки всплеск апоптоза сократил количество ИКС до минимума, необходимого для эффективного создания решетки ячеек входного материала через глаз соединения.

После освоения визуализация СИЗ может быть выполнена за четыре часа при правильном выполнении. Последующая обработка изображения занимает около часа.