Введение в клеточную и молекулярную нейробиологию
Самые простые рефлексы и самые возвышенные эмоциональные переживания уходят корнями в молекулярные, генетические и клеточные структуры мозга. Являясь одной из новейших областей нейронауки, клеточная и молекулярная нейробиология использует методы молекулярной биологии для изучения того, как гены, сигнальные молекулы и клеточная морфология влияют на нервную систему
В данном видео будут представлены знаковые открытия в этой области, рассмотрены ключевые вопросы исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии и, наконец, продемонстрированы несколько основных методов, которые могут быть применены для поиска ответов на эти вопросы.
Для начала обратимся к научным истокам этой относительно молодой области.
До появления молекулярных методов в ранней истории нейробиологии доминировали анатомы и клеточные биологи.
Однако в 1930-х годах приток физиков, химиков и теоретиков в ряды биологов положил начало молекулярной революции, кульминацией которой стало открытие Уотсоном и Криком структуры DNA и формулировка центральной догмы, объясняющей, как DNA кодирует белки, которые служат функциональными единицами клеток. Впервые нейробиологи получили возможность исследовать роль конкретных генов и белков в функционировании нервной системы.
Например, в 1960-х годах Сеймур Бензер смог связать поведенческие изменения у плодовых мушек с конкретными генетическими мутациями, выявив ключевые гены, экспрессируемые в нейронах, которые контролируют поведение, например, локомоцию.
В тот же период Эрик Кандель продемонстрировал, что такие сложные процессы, как обучение, также имеют молекулярную основу. Используя морского моллюска Aplysia, он проанализировал экстракты нейронных тканей и указал на роль внутриклеточной сигнальной молекулы циклического AMP в пути, имеющем критическое значение для обучения.
Затем, в 1980-х годах, сотрудники лаборатории Сёсаку Нума первыми клонировали ключевые молекулы, обеспечивающие функцию нейронов, такие как потенциалзависимый натриевый канал. Последующий анализ функциональных доменов этих крупных мембранных белков углубил наше понимание того, как управление движением ионов приводит к возбуждению нейрона.
Еще одно важное открытие в области молекулярных механизмов нейронной коммуникации было сделано в 1990-х годах, когда Томас Судхофф обнаружил, что ионы кальция изменяют форму белков, которые заякоривают заполненные нейромедиаторами везикулы у клеточной мембраны. Это объяснило, каким образом потенциалы действия приводят к точно синхронизированному высвобождению химических сигналов в синапс.
От нейрофизиологии до изучения поведения — открытия в области молекулярной нейробиологии расширили наше понимание многих нейробиологических дисциплин.
Несмотря на эту плодотворную историю, предстоит узнать еще многое! Давайте рассмотрим некоторые вопросы, которые сегодня изучаются в лабораториях.
Одно из направлений исследований посвящено поиску генов, влияющих на функцию нейронов. Например, известно, что экспансии нуклеотидов в определенных генах участвуют в развитии ряда заболеваний, характеризующихся постепенным ухудшением состояния нейронов, таких как болезнь Гентингтона.
Другая группа исследуемых генов кодирует факторы транскрипции — белки, регулирующие экспрессию специфических генов. Определение мишеней ДНК для факторов транскрипции, специфичных для нервной системы, может дать нам более четкое представление о генетической программе, обеспечивающей мышление.
Кроме того, нейробиологи могут изучать механизмы регуляции поведения нейронов молекулами. Например, они могут исследовать молекулярный аппарат, регулирующий движение ионов через клеточную мембрану, что приводит к распространению потенциалов действия. Исследования в этой области позволили создать такие анестетики, как лидокаин, который блокирует определенные ионные каналы и останавливает передачу болевых сигналов в мозг.
Также ученые могут изучать места взаимодействия между нейронами, называемые синапсами. Здесь они могут выяснять, какие молекулы участвуют в поддержании целостности синапса и как эти связи могут быть восстановлены при патологических состояниях.
Нейронная пластичность — это способность нервной системы химически и физически адаптироваться в ответ на полученный опыт. Некоторые исследования в этой области сосредоточены на зависимых от опыта морфологических изменениях в сложных нейронных структурах, известных как дендритные деревья, которые формируют синапсы через высокодинамичные структуры, называемые дендритными шипиками. Других интересует, как опыт может изменять распределение рецепторов нейромедиаторов на синаптических мембранах, что может усилить сигнальную мощность синапса в результате феномена, известного как долгосрочная потенциация, или LTP.
Как видите, специалисты по клеточной и молекулярной нейробиологии подходят к изучению нейробиологии с микроскопической точки зрения, однако спектр изучаемых ими процессов чрезвычайно широк.
Теперь, когда вы ознакомились с некоторыми из наиболее актуальных вопросов, которые исследуются в лабораториях клеточной и молекулярной нейробиологии, давайте рассмотрим инструменты, доступные для поиска ответов на них.
Во-первых, для изучения генетического контроля функций нейронов ученые располагают очень мощными методами. Например, микрочипы позволяют количественно определить экспрессию огромного количества генов одновременно. Микрочип представляет собой поверхность, к которой прикреплены десятки тысяч коротких одноцепочечных фрагментов ДНК — «зондов». Генетический материал, экстрагированный из нейрона, связывается с этими зондами, а флуоресцентные маркеры используются для визуализации того, какие именно последовательности присутствуют в образце.
В качестве альтернативы ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР используют оборудование, позволяющее косвенно измерять относительное количество специфических транскриптов мРНК с помощью метода ПЦР. Этот подход крайне полезен для определения уровней экспрессии отдельных генов.
И, наконец, трансгенные технологии являются важным инструментом исследования функций генов в нервной системе. С помощью этого метода исследователи могут создавать животных с удаленными участками генома (так называемые нокауты) или с модифицированными генами, встроенными в их генетический код (трансгенные животные). Ткани нервной системы таких животных можно анализировать различными способами, чтобы определить, как изменения в экспрессии генов влияют на клеточную функцию.
Для изучения молекулярного контроля нейронной сигнализации исследователи часто предпочитают изучать ткани мозга вне организма животного — либо в виде небольших фрагментов ткани, либо в виде диссоциированных клеток, выращенных in vitro, которые называются первичными нейронными культурами. Одним из преимуществ этой упрощенной системы является возможность эффективно манипулировать экспрессией интересующих генов нейронной сигнализации путем трансфекции. Результаты этих генетических манипуляций затем можно наблюдать с помощью визуализации локализации белков, анализа морфологии клеток или электрофизиологических записей.
Наконец, значительные успехи в технологиях визуализации позволяют ученым изучать нейронную пластичность новыми захватывающими способами. Например, исследователи могут использовать двухфотонную микроскопию для детальной визуализации глубоких слоев живых тканей. После создания «окна» в черепе этот метод можно использовать для получения изображений морфологии клеток мозга до и после определенного опыта, что позволяет исследователям увидеть, как выглядит процесс обучения на нейронном уровне.
Инструменты визуализации также используются для исследования молекулярных компонентов нервной системы в фиксированных тканях. Флуоресцентная микроскопия часто применяется в сочетании с иммуногистохимией, при которой образцы окрашиваются флуоресцентными антителами, маркирующими клеточную локализацию специфических белков.
Рассмотрев основные вопросы и инструменты, используемые для их решения, перейдем к некоторым примерам применения исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии.
Во-первых, применяя методы микрочипового анализа к небольшой популяции нейронов, исследователи могут изучить различия в экспрессии различных генов в конкретных подтипах нейронов. В данном случае из сетчатки были изолированы отдельные нейроны и экстрагирована клеточная РНК, что позволило исследователям профилировать экспрессию мРНК в клетках с разными функциональными и морфологическими характеристиками.
Молекулярные методы также могут быть использованы для более глубокого понимания реакции нервной системы на повреждение. При выделении ганглиев задних корешков (DRGs) у взрослых мышей для создания первичной культуры нейронов аксоны неизбежно перерезаются. Путем трансфекции диссоциированных нейронов DRG конструктами для сайленсинга генов можно протестировать влияние отдельных белков на регенерацию новых аксонов.
Специализированные методы визуализации позволяют изучать транспорт таких белков, как рецепторы нейромедиаторов, к синаптической мембране и обратно. В этом эксперименте культивируемые нейроны были трансфицированы геном, кодирующим мембранный белок с флуоресцентной меткой. Затем с помощью конфокального микроскопа небольшие участки мембраны подвергались фотообесцвечиванию, что приводило к разрушению флуорофоров в этой области. При используемой здесь схеме обесцвечивания постепенное восстановление флуоресценции, или FRAP, отражает транспорт новых флуоресцентных белков в плазматическую мембрану. Скорость этого процесса может быть количественно определена и сопоставлена при различных экспериментальных условиях.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по клеточной и молекулярной нейробиологии. В этом ролике мы обсудили исторические открытия, благодаря которым клеточная и молекулярная нейробиология стала такой, какая она есть сегодня, некоторые ключевые вопросы этой области и методы, используемые для их решения.
Как всегда, спасибо за просмотр JoVE Science Education!
Клеточная и молекулярная нейробиология является одной из самых новых и быстро развивающихся субдисциплин в области нейронаук. Исследуя влияние генов,…
Самые простые рефлексы и самые возвышенные эмоциональные переживания уходят корнями в молекулярные, генетические и клеточные структуры мозга.Являясь одной из новейших областей нейронауки, клеточная и молекулярная нейробиология использует методы молекулярной биологии для изучения того, как гены, сигнальные молекулы и клеточная морфология влияют на нервную систему
В данном видео будут представлены знаковые открытия в этой области, рассмотрены ключевые вопросы исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии и, наконец, продемонстрированы несколько основных методов, которые могут быть применены для поиска ответов на эти вопросы.
Для начала обратимся к научным истокам этой относительно молодой области.
До появления молекулярных методов в ранней истории нейробиологии доминировали анатомы и клеточные биологи.
Однако в 1930-х годах приток физиков, химиков и теоретиков в ряды биологов положил начало молекулярной революции, кульминацией которой стало открытие Уотсоном и Криком структуры DNA и формулировка центральной догмы, объясняющей, как DNA кодирует белки, которые служат функциональными единицами клеток. Впервые нейробиологи получили возможность исследовать роль конкретных генов и белков в функционировании нервной системы.
Например, в 1960-х годах Сеймур Бензер смог связать поведенческие изменения у плодовых мушек с конкретными генетическими мутациями, выявив ключевые гены, экспрессируемые в нейронах, которые контролируют поведение, например, локомоцию.
В тот же период Эрик Кандель продемонстрировал, что такие сложные процессы, как обучение, также имеют молекулярную основу.Используя морского моллюска Aplysia, он проанализировал экстракты нейронных тканей и указал на роль внутриклеточной сигнальной молекулы циклического AMP в пути, имеющем критическое значение для обучения.
Затем, в 1980-х годах, сотрудники лаборатории Сёсаку Нума первыми клонировали ключевые молекулы, обеспечивающие функцию нейронов, такие как потенциалзависимый натриевый канал. Последующий анализ функциональных доменов этих крупных мембранных белков углубил наше понимание того, как управление движением ионов приводит к возбуждению нейрона.
Еще одно важное открытие в области молекулярных механизмов нейронной коммуникации было сделано в 1990-х годах, когда Томас Судхофф обнаружил, что ионы кальция изменяют форму белков, которые заякоривают заполненные нейромедиаторами везикулы у клеточной мембраны. Это объяснило, каким образом потенциалы действия приводят к точно синхронизированному высвобождению химических сигналов в синапс.
От нейрофизиологии до изучения поведения — открытия в области молекулярной нейробиологии расширили наше понимание многих нейробиологических дисциплин.
Несмотря на эту плодотворную историю, предстоит узнать еще многое! Давайте рассмотрим некоторые вопросы, которые сегодня изучаются в лабораториях.
Одно из направлений исследований посвящено поиску генов, влияющих на функцию нейронов. Например, известно, что экспансии нуклеотидов в определенных генах участвуют в развитии ряда заболеваний, характеризующихся постепенным ухудшением состояния нейронов, таких как болезнь Гентингтона.
Другая группа исследуемых генов кодирует факторы транскрипции — белки, регулирующие экспрессию специфических генов. Определение мишеней ДНК для факторов транскрипции, специфичных для нервной системы, может дать нам более четкое представление о генетической программе, обеспечивающей мышление.
Кроме того, нейробиологи могут изучать механизмы регуляции поведения нейронов молекулами. Например, они могут исследовать молекулярный аппарат, регулирующий движение ионов через клеточную мембрану, что приводит к распространению потенциалов действия. Исследования в этой области позволили создать такие анестетики, как лидокаин, который блокирует определенные ионные каналы и останавливает передачу болевых сигналов в мозг.
Также ученые могут изучать места взаимодействия между нейронами, называемые синапсами. Здесь они могут выяснять, какие молекулы участвуют в поддержании целостности синапса и как эти связи могут быть восстановлены при патологических состояниях.
Нейронная пластичность — это способность нервной системы химически и физически адаптироваться в ответ на полученный опыт.Некоторые исследования в этой области сосредоточены на зависимых от опыта морфологических изменениях в сложных нейронных структурах, известных как дендритные деревья, которые формируют синапсы через высокодинамичные структуры, называемые дендритными шипиками.Других интересует, как опыт может изменять распределение рецепторов нейромедиаторов на синаптических мембранах, что может усилить сигнальную мощность синапса в результате феномена, известного как долгосрочная потенциация, или LTP.
Как видите, специалисты по клеточной и молекулярной нейробиологии подходят к изучению нейробиологии с микроскопической точки зрения, однако спектр изучаемых ими процессов чрезвычайно широк.
Теперь, когда вы ознакомились с некоторыми из наиболее актуальных вопросов, которые исследуются в лабораториях клеточной и молекулярной нейробиологии, давайте рассмотрим инструменты, доступные для поиска ответов на них.
Во-первых, для изучения генетического контроля функций нейронов ученые располагают очень мощными методами.Например, микрочипы позволяют количественно определить экспрессию огромного количества генов одновременно. Микрочип представляет собой поверхность, к которой прикреплены десятки тысяч коротких одноцепочечных фрагментов ДНК — «зондов». Генетический материал, экстрагированный из нейрона, связывается с этими зондами, а флуоресцентные маркеры используются для визуализации того, какие именно последовательности присутствуют в образце.
В качестве альтернативы ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР используют оборудование, позволяющее косвенно измерять относительное количество специфических транскриптов мРНК с помощью метода ПЦР. Этот подход крайне полезен для определения уровней экспрессии отдельных генов.
И, наконец, трансгенные технологии являются важным инструментом исследования функций генов в нервной системе. С помощью этого метода исследователи могут создавать животных с удаленными участками генома (так называемые нокауты) или с модифицированными генами, встроенными в их генетический код (трансгенные животные). Ткани нервной системы таких животных можно анализировать различными способами, чтобы определить, как изменения в экспрессии генов влияют на клеточную функцию.
Для изучения молекулярного контроля нейронной сигнализации исследователи часто предпочитают изучать ткани мозга вне организма животного — либо в виде небольших фрагментов ткани, либо в виде диссоциированных клеток, выращенных in vitro, которые называются первичными нейронными культурами.Одним из преимуществ этой упрощенной системы является возможность эффективно манипулировать экспрессией интересующих генов нейронной сигнализации путем трансфекции. Результаты этих генетических манипуляций затем можно наблюдать с помощью визуализации локализации белков, анализа морфологии клеток или электрофизиологических записей.
Наконец, значительные успехи в технологиях визуализации позволяют ученым изучать нейронную пластичность новыми захватывающими способами.Например, исследователи могут использовать двухфотонную микроскопию для детальной визуализации глубоких слоев живых тканей. После создания «окна» в черепе этот метод можно использовать для получения изображений морфологии клеток мозга до и после определенного опыта, что позволяет исследователям увидеть, как выглядит процесс обучения на нейронном уровне.
Инструменты визуализации также используются для исследования молекулярных компонентов нервной системы в фиксированных тканях. Флуоресцентная микроскопия часто применяется в сочетании с иммуногистохимией, при которой образцы окрашиваются флуоресцентными антителами, маркирующими клеточную локализацию специфических белков.
Рассмотрев основные вопросы и инструменты, используемые для их решения, перейдем к некоторым примерам применения исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии.
Во-первых, применяя методы микрочипового анализа к небольшой популяции нейронов, исследователи могут изучить различия в экспрессии различных генов в конкретных подтипах нейронов. В данном случае из сетчатки были изолированы отдельные нейроны и экстрагирована клеточная РНК, что позволило исследователям профилировать экспрессию мРНК в клетках с разными функциональными и морфологическими характеристиками.
Молекулярные методы также могут быть использованы для более глубокого понимания реакции нервной системы на повреждение. При выделении ганглиев задних корешков (DRGs) у взрослых мышей для создания первичной культуры нейронов аксоны неизбежно перерезаются. Путем трансфекции диссоциированных нейронов DRG конструктами для сайленсинга генов можно протестировать влияние отдельных белков на регенерацию новых аксонов.
Специализированные методы визуализации позволяют изучать транспорт таких белков, как рецепторы нейромедиаторов, к синаптической мембране и обратно. В этом эксперименте культивируемые нейроны были трансфицированы геном, кодирующим мембранный белок с флуоресцентной меткой. Затем с помощью конфокального микроскопа небольшие участки мембраны подвергались фотообесцвечиванию, что приводило к разрушению флуорофоров в этой области. При используемой здесь схеме обесцвечивания постепенное восстановление флуоресценции, или FRAP, отражает транспорт новых флуоресцентных белков в плазматическую мембрану. Скорость этого процесса может быть количественно определена и сопоставлена при различных экспериментальных условиях.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по клеточной и молекулярной нейробиологии. В этом ролике мы обсудили исторические открытия, благодаря которым клеточная и молекулярная нейробиология стала такой, какая она есть сегодня, некоторые ключевые вопросы этой области и методы, используемые для их решения.
Как всегда, спасибо за просмотр JoVE Science Education!
Самые простые рефлексы и самые возвышенные эмоциональные переживания уходят корнями в молекулярные, генетические и клеточные структуры мозга. Являясь одной из новейших областей нейронауки, клеточная и молекулярная нейробиология использует методы молекулярной биологии для изучения того, как гены, сигнальные молекулы и клеточная морфология влияют на нервную систему
В данном видео будут представлены знаковые открытия в этой области, рассмотрены ключевые вопросы исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии и, наконец, продемонстрированы несколько основных методов, которые могут быть применены для поиска ответов на эти вопросы.
Для начала обратимся к научным истокам этой относительно молодой области.
До появления молекулярных методов в ранней истории нейробиологии доминировали анатомы и клеточные биологи.
Однако в 1930-х годах приток физиков, химиков и теоретиков в ряды биологов положил начало молекулярной революции, кульминацией которой стало открытие Уотсоном и Криком структуры DNA и формулировка центральной догмы, объясняющей, как DNA кодирует белки, которые служат функциональными единицами клеток. Впервые нейробиологи получили возможность исследовать роль конкретных генов и белков в функционировании нервной системы.
Например, в 1960-х годах Сеймур Бензер смог связать поведенческие изменения у плодовых мушек с конкретными генетическими мутациями, выявив ключевые гены, экспрессируемые в нейронах, которые контролируют поведение, например, локомоцию.
В тот же период Эрик Кандель продемонстрировал, что такие сложные процессы, как обучение, также имеют молекулярную основу. Используя морского моллюска Aplysia, он проанализировал экстракты нейронных тканей и указал на роль внутриклеточной сигнальной молекулы циклического AMP в пути, имеющем критическое значение для обучения.
Затем, в 1980-х годах, сотрудники лаборатории Сёсаку Нума первыми клонировали ключевые молекулы, обеспечивающие функцию нейронов, такие как потенциалзависимый натриевый канал. Последующий анализ функциональных доменов этих крупных мембранных белков углубил наше понимание того, как управление движением ионов приводит к возбуждению нейрона.
Еще одно важное открытие в области молекулярных механизмов нейронной коммуникации было сделано в 1990-х годах, когда Томас Судхофф обнаружил, что ионы кальция изменяют форму белков, которые заякоривают заполненные нейромедиаторами везикулы у клеточной мембраны. Это объяснило, каким образом потенциалы действия приводят к точно синхронизированному высвобождению химических сигналов в синапс.
От нейрофизиологии до изучения поведения — открытия в области молекулярной нейробиологии расширили наше понимание многих нейробиологических дисциплин.
Несмотря на эту плодотворную историю, предстоит узнать еще многое! Давайте рассмотрим некоторые вопросы, которые сегодня изучаются в лабораториях.
Одно из направлений исследований посвящено поиску генов, влияющих на функцию нейронов. Например, известно, что экспансии нуклеотидов в определенных генах участвуют в развитии ряда заболеваний, характеризующихся постепенным ухудшением состояния нейронов, таких как болезнь Гентингтона.
Другая группа исследуемых генов кодирует факторы транскрипции — белки, регулирующие экспрессию специфических генов. Определение мишеней ДНК для факторов транскрипции, специфичных для нервной системы, может дать нам более четкое представление о генетической программе, обеспечивающей мышление.
Кроме того, нейробиологи могут изучать механизмы регуляции поведения нейронов молекулами. Например, они могут исследовать молекулярный аппарат, регулирующий движение ионов через клеточную мембрану, что приводит к распространению потенциалов действия. Исследования в этой области позволили создать такие анестетики, как лидокаин, который блокирует определенные ионные каналы и останавливает передачу болевых сигналов в мозг.
Также ученые могут изучать места взаимодействия между нейронами, называемые синапсами. Здесь они могут выяснять, какие молекулы участвуют в поддержании целостности синапса и как эти связи могут быть восстановлены при патологических состояниях.
Нейронная пластичность — это способность нервной системы химически и физически адаптироваться в ответ на полученный опыт. Некоторые исследования в этой области сосредоточены на зависимых от опыта морфологических изменениях в сложных нейронных структурах, известных как дендритные деревья, которые формируют синапсы через высокодинамичные структуры, называемые дендритными шипиками. Других интересует, как опыт может изменять распределение рецепторов нейромедиаторов на синаптических мембранах, что может усилить сигнальную мощность синапса в результате феномена, известного как долгосрочная потенциация, или LTP.
Как видите, специалисты по клеточной и молекулярной нейробиологии подходят к изучению нейробиологии с микроскопической точки зрения, однако спектр изучаемых ими процессов чрезвычайно широк.
Теперь, когда вы ознакомились с некоторыми из наиболее актуальных вопросов, которые исследуются в лабораториях клеточной и молекулярной нейробиологии, давайте рассмотрим инструменты, доступные для поиска ответов на них.
Во-первых, для изучения генетического контроля функций нейронов ученые располагают очень мощными методами. Например, микрочипы позволяют количественно определить экспрессию огромного количества генов одновременно. Микрочип представляет собой поверхность, к которой прикреплены десятки тысяч коротких одноцепочечных фрагментов ДНК — «зондов». Генетический материал, экстрагированный из нейрона, связывается с этими зондами, а флуоресцентные маркеры используются для визуализации того, какие именно последовательности присутствуют в образце.
В качестве альтернативы ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР используют оборудование, позволяющее косвенно измерять относительное количество специфических транскриптов мРНК с помощью метода ПЦР. Этот подход крайне полезен для определения уровней экспрессии отдельных генов.
И, наконец, трансгенные технологии являются важным инструментом исследования функций генов в нервной системе. С помощью этого метода исследователи могут создавать животных с удаленными участками генома (так называемые нокауты) или с модифицированными генами, встроенными в их генетический код (трансгенные животные). Ткани нервной системы таких животных можно анализировать различными способами, чтобы определить, как изменения в экспрессии генов влияют на клеточную функцию.
Для изучения молекулярного контроля нейронной сигнализации исследователи часто предпочитают изучать ткани мозга вне организма животного — либо в виде небольших фрагментов ткани, либо в виде диссоциированных клеток, выращенных in vitro, которые называются первичными нейронными культурами. Одним из преимуществ этой упрощенной системы является возможность эффективно манипулировать экспрессией интересующих генов нейронной сигнализации путем трансфекции. Результаты этих генетических манипуляций затем можно наблюдать с помощью визуализации локализации белков, анализа морфологии клеток или электрофизиологических записей.
Наконец, значительные успехи в технологиях визуализации позволяют ученым изучать нейронную пластичность новыми захватывающими способами. Например, исследователи могут использовать двухфотонную микроскопию для детальной визуализации глубоких слоев живых тканей. После создания «окна» в черепе этот метод можно использовать для получения изображений морфологии клеток мозга до и после определенного опыта, что позволяет исследователям увидеть, как выглядит процесс обучения на нейронном уровне.
Инструменты визуализации также используются для исследования молекулярных компонентов нервной системы в фиксированных тканях. Флуоресцентная микроскопия часто применяется в сочетании с иммуногистохимией, при которой образцы окрашиваются флуоресцентными антителами, маркирующими клеточную локализацию специфических белков.
Рассмотрев основные вопросы и инструменты, используемые для их решения, перейдем к некоторым примерам применения исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии.
Во-первых, применяя методы микрочипового анализа к небольшой популяции нейронов, исследователи могут изучить различия в экспрессии различных генов в конкретных подтипах нейронов. В данном случае из сетчатки были изолированы отдельные нейроны и экстрагирована клеточная РНК, что позволило исследователям профилировать экспрессию мРНК в клетках с разными функциональными и морфологическими характеристиками.
Молекулярные методы также могут быть использованы для более глубокого понимания реакции нервной системы на повреждение. При выделении ганглиев задних корешков (DRGs) у взрослых мышей для создания первичной культуры нейронов аксоны неизбежно перерезаются. Путем трансфекции диссоциированных нейронов DRG конструктами для сайленсинга генов можно протестировать влияние отдельных белков на регенерацию новых аксонов.
Специализированные методы визуализации позволяют изучать транспорт таких белков, как рецепторы нейромедиаторов, к синаптической мембране и обратно. В этом эксперименте культивируемые нейроны были трансфицированы геном, кодирующим мембранный белок с флуоресцентной меткой. Затем с помощью конфокального микроскопа небольшие участки мембраны подвергались фотообесцвечиванию, что приводило к разрушению флуорофоров в этой области. При используемой здесь схеме обесцвечивания постепенное восстановление флуоресценции, или FRAP, отражает транспорт новых флуоресцентных белков в плазматическую мембрану. Скорость этого процесса может быть количественно определена и сопоставлена при различных экспериментальных условиях.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по клеточной и молекулярной нейробиологии. В этом ролике мы обсудили исторические открытия, благодаря которым клеточная и молекулярная нейробиология стала такой, какая она есть сегодня, некоторые ключевые вопросы этой области и методы, используемые для их решения.
Как всегда, спасибо за просмотр JoVE Science Education!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is cellular and molecular neuroscience?
Cellular and molecular neuroscience is a subdiscipline that leverages molecular biology to explore how genes, signaling molecules, and cellular morphology influence the nervous system. It combines techniques from molecular biology with neuroscience to understand normal brain function and pathological conditions. This field emerged in the 1930s when physicists, chemists, and theoreticians joined biologists, enabling investigation of specific genes and proteins in nervous system function.
Q2: How do microarrays measure gene expression in neurons?
Microarrays are surfaces with tens of thousands of single-stranded DNA probes attached. Genetic material extracted from neurons binds to these probes, and fluorescent markers visualize which sequences are present. This technique allows simultaneous quantification of expression across a huge number of genes, making it powerful for profiling neuronal subtypes and identifying differences in gene expression patterns.
Q3: What role do calcium ions play in neurotransmitter release?
Calcium ions alter the shape of proteins that anchor neurotransmitter-filled vesicles to the cell membrane. This discovery by Thomas Sudhof in the 1990s explained how action potentials lead to precisely timed release of chemical signals into the synapse. Understanding this molecular mechanism revealed the link between neuronal electrical activity and chemical communication between neurons.
Q4: How do researchers study neuronal plasticity using imaging?
Two-photon microscopy allows visualization of deep layers in living tissues with great detail. After creating a window in the skull, researchers can image brain cell morphology before and after animals undergo experiences, revealing what learning looks like at the neuronal level. This imaging approach enables direct observation of experience-dependent changes in dendritic arbors and synaptic structures.
Q5: What is transfection and why is it useful in neuronal research?
Transfection is a method to efficiently manipulate gene expression in neurons by introducing modified genetic material into cells. Researchers use transfection to study molecular control of neuronal signaling in primary neuronal cultures grown in vitro. Results can be observed through protein localization visualization, cell morphology analysis, or electrophysiological recordings to determine how genetic changes affect cellular function.
Q6: How do voltage-gated sodium channels relate to neuronal firing?
Voltage-gated sodium channels are key molecules in neuron function that control ion movements across the cell membrane. When these channels were first cloned in the 1980s, analysis of their functional domains improved understanding of how ion movement regulation leads to neuron firing. This discovery was foundational to understanding the molecular basis of neuronal electrical activity and action potential propagation.
Q7: What does FRAP reveal about protein transport in neurons?
FRAP, or fluorescence recovery after photobleaching, measures protein transport to and from synaptic membranes. Cultured neurons are transfected with fluorescently tagged membrane proteins, then small membrane regions are photobleached to destroy fluorophores. Progressive fluorescence recovery reflects transport of new proteins into the plasma membrane, and the rate of movement can be quantified and compared across experimental conditions.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:53
The History of Molecular Neuroscience
3:26
Key Questions
5:49
Prominent Methods
9:02
Applications
10:55
Summary