Введение в клеточную и молекулярную нейробиологию
Простейшие рефлексы на самые возвышенные эмоциональные переживания коренятся в молекулярных, генетических и клеточных структурах мозга. Являясь одной из новейших областей нейробиологии, клеточная и молекулярная нейробиология использует молекулярную биологию для изучения того, как гены, сигнальные молекулы и клеточная морфология влияют на нервную систему
В этом видео будут представлены знаковые открытия в этой области, затронуты ключевые вопросы исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии и, наконец, продемонстрируются несколько известных методов, которые могут быть применены для ответа на эти вопросы.
Давайте начнем с того, что оглянемся назад на научные корни этой относительно молодой области.
До появления молекулярных методов анатомы и клеточные биологи доминировали в ранней истории нейробиологии.
Однако в 1930-х годах приток физиков, химиков и теоретиков в ряды биологов положил начало молекулярной революции, кульминацией которой стало открытие Уотсоном и Криком структуры ДНК и формализация центральной догмы, объясняющей, как ДНК кодирует белки, выступающие в качестве функциональных единиц клеток. Впервые нейробиологи смогли исследовать роль, которую специфические гены и белки играют в функционировании нервной системы.
Например, в 1960-х годах Сеймур Бензер смог связать поведенческие изменения у плодовых мушек с конкретными генетическими мутациями, определив ключевые гены, экспрессируемые в нейронах, контролирующих поведение, например, локомоцию.
В тот же период времени Эрик Кандел продемонстрировал, что сложные процессы, такие как обучение, также имеют молекулярную основу. Используя морского моллюска Aplysia, он проанализировал экстракты нейронных тканей и включил внутриклеточную сигнальную молекулу циклического АМФ в путь, критически важный для обучения.
Затем, в 1980-х годах, сотрудники лаборатории Сёсаку Нумы были первыми, кто клонировал ключевые молекулы в функции нейронов, такие как потенциальный натриевый канал. Анализ функциональных доменов в этих больших мембранных белках с тех пор улучшил наше понимание того, как контроль движения ионов приводит к возбуждению нейронов.
Еще одно важное открытие в молекулярных механизмах нейронной коммуникации произошло в 1990-х годах, когда Томас Судхоф обнаружил, что ионы кальция изменяют форму белков, которые прикрепляют наполненные нейротрансмиттером везикулы к клеточной мембране, объясняя, как потенциалы действия приводят к точно синхронизированному высвобождению химических сигналов в синапс.
От нейрофизиологии до поведения, открытия в молекулярной нейробиологии улучшили наше понимание многих нейронаучных дисциплин.
Несмотря на эту продуктивную историю, еще многому предстоит научиться! Давайте рассмотрим некоторые вопросы, которые сегодня задаются в лабораториях.
Одна из областей исследований заключается в том, какие гены влияют на функцию нейронов. Например, известно, что нуклеотидные экспансии в определенных генах участвуют в нескольких заболеваниях, характеризующихся устойчивым ухудшением здоровья нейронов, таких как болезнь Хантингтона.
Другая исследуемая группа генов кодирует факторы транскрипции: белки, которые регулируют экспрессию определенных генов. Идентификация ДНК-мишеней специфических для нервной системы факторов транскрипции может дать нам лучшее представление о генетической программе, которая заставляет нас думать.
В качестве альтернативы нейробиологи могут задаться вопросом, как молекулы регулируют поведение нейронов. Например, они могут изучать молекулярный механизм, регулирующий движение ионов через клеточную мембрану, что приводит к распространению потенциалов действия. Исследования дали нам анестетики, такие как лидокаин, который блокирует определенные ионные каналы и останавливает передачу болевых сигналов в мозг.
В качестве альтернативы ученые могут исследовать места взаимодействия между нейронами, известные как синапс. Здесь они могут задаться вопросом, какие молекулы участвуют в сохранении целостности синапса и как эти связи могут быть восстановлены при болезненных состояниях.
Нейрональная пластичность — это способность нервной системы химически и физически адаптироваться в ответ на опыт. Некоторые исследования в этой области сосредоточены на зависящих от опыта морфологических изменениях в сложных нейронных структурах, известных как дендритные беседки, которые образуют синапсы через высокодинамичные структуры, называемые дендритными шипами. Других интересует, как опыт может изменить распределение рецепторов нейротрансмиттеров на синаптических мембранах, что может усилить сигнальную мощность синапса в феномене, известном как долгосрочная потенциация, или LTP.
Как видите, клеточные и молекулярные нейробиологи подходят к нейробиологии с микроскопической точки зрения, но спектр процессов, которые они изучают, обширен.
Теперь, когда вы знакомы с некоторыми интересными вопросами, которые задаются в лабораториях клеточной и молекулярной нейробиологии, давайте рассмотрим инструменты, доступные для ответа на них.
Во-первых, чтобы исследовать генетический контроль функции нейронов, ученые имеют в своем распоряжении несколько очень мощных методов. Например, микрочипы могут количественно оценить экспрессию огромного количества генов одновременно. Микрочип — это поверхность с прикрепленными к ней десятками тысяч фрагментов одноцепочечных «зондов» ДНК. Генетический материал, извлеченный из нейрона, связывается с зондами, а флуоресцентные маркеры используются для точной визуализации того, какие последовательности присутствуют в образце.
В качестве альтернативы, для количественной ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР используется оборудование, которое может косвенно измерять относительное количество конкретных транскриптов мРНК с помощью метода на основе ПЦР. Этот подход чрезвычайно полезен для определения уровней экспрессии отдельных генов.
И последнее, но не менее важное: трансгенная технология является важным инструментом для исследования функции генов в нервной системе. С помощью этого метода исследователи могут создавать животных с удаленными частями генома, известными как нокауты, или с модифицированными генами, вставленными в их генетический код, известными как трансгенные. Ткани нервной системы этих животных могут быть проанализированы различными способами, чтобы определить, как изменения в экспрессии генов влияют на клеточную функцию.
Чтобы изучить молекулярный контроль нейронной сигнализации, исследователи часто предпочитают изучать ткани мозга за пределами животного, либо в небольших кусочках ткани, либо в диссоциированных клетках, выращенных in vitro, называемых первичными нейрональными культурами. Одним из преимуществ этой упрощенной системы является возможность эффективно манипулировать экспрессией генов, представляющих интерес для нейронной сигнализации, путем трансфекции. Результаты этих генетических манипуляций затем можно наблюдать с помощью визуализации локализации белка, анализа морфологии клеток или электрофизиологических записей.
Наконец, впечатляющие достижения в технологии визуализации позволяют ученым изучать нейрональную пластичность новыми захватывающими способами. Например, исследователи могут использовать двухфотонную микроскопию для визуализации глубоких слоев живых тканей в мельчайших подробностях. После создания «окна» в черепе этот метод может быть использован для визуализации морфологии клеток мозга до и после того, как животные проходят через опыт, что позволяет исследователям увидеть, как выглядит обучение на нейронном уровне.
Инструменты визуализации также используются для исследования молекулярных компонентов нервной системы в сохранившихся тканях. Флуоресцентная микроскопия часто используется в сочетании с иммуногистохимией, при которой образцы окрашиваются флуоресцентными антителами, отмечающими клеточную локализацию специфических белков.
Рассмотрев оба важных вопроса и инструменты, используемые для ответа на них, давайте рассмотрим некоторые области применения исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии.
Во-первых, применяя методы микрочипов к небольшой популяции нейронов, исследователи могут изучить различия в экспрессии различных генов в конкретных подтипах нейронов. Здесь отдельные нейроны были выделены из сетчатки и извлечена клеточная РНК, что позволило исследователям профилировать экспрессию мРНК из клеток с различными функциональными и морфологическими характеристиками.
Молекулярные методы также могут быть применены для лучшего понимания реакции нервной системы на травму. Когда ганглии дорсальных корешков, или DRG, удаляются у взрослых мышей для первичной культуры нейронов, аксоны обязательно разрываются. Трансфектируя диссоциированные нейроны DRG с помощью конструкций сайленсинга генов, можно проверить влияние отдельных белков на повторный рост новых аксонов.
Специализированные методы визуализации могут быть использованы для изучения того, как белки, такие как рецепторы нейротрансмиттеров, транспортируются к синаптической мембране и обратно. В этом эксперименте культивируемые нейроны были трансфицированы геном, кодирующим мембранный белок с флуоресцентной меткой. С помощью конфокального микроскопа небольшие участки мембраны были затем фотообесцвечены, что означает, что флуорофоры в этой области были разрушены. При использовании здесь схемы обесцвечивания прогрессивное восстановление флуоресценции, или FRAP, отражает транспорт новых флуоресцентных белков в плазматическую мембрану. Скорость, с которой происходит это движение, может быть количественно определена и сравнена во многих экспериментальных условиях.
Вы только что посмотрели введение JoVE в клеточную и молекулярную нейробиологию. В этом видео мы обсудили исторические открытия, которые сделали клеточную и молекулярную нейробиологию той областью, которой она является сегодня, некоторые ключевые вопросы в этой области и методы, используемые для ответа на них.
Как всегда, спасибо за просмотр JoVE Science Education!
Клеточная и молекулярная нейронаука является одной из самых новых и быстрорастущих дисциплин в нейронауке. Исследуя влияние генов, сигнальных молекул…
Простейшие рефлексы на самые возвышенные эмоциональные переживания коренятся в молекулярных, генетических и клеточных структурах мозга. Являясь одной из новейших областей нейробиологии, клеточная и молекулярная нейробиология использует молекулярную биологию для изучения того, как гены, сигнальные молекулы и клеточная морфология влияют на нервную систему
В этом видео будут представлены знаковые открытия в этой области, затронуты ключевые вопросы исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии и, наконец, продемонстрируются несколько известных методов, которые могут быть применены для ответа на эти вопросы.
Давайте начнем с того, что оглянемся назад на научные корни этой относительно молодой области.
До появления молекулярных методов анатомы и клеточные биологи доминировали в ранней истории нейробиологии.
Однако в 1930-х годах приток физиков, химиков и теоретиков в ряды биологов положил начало молекулярной революции, кульминацией которой стало открытие Уотсоном и Криком структуры ДНК и формализация центральной догмы, объясняющей, как ДНК кодирует белки, выступающие в качестве функциональных единиц клеток. Впервые нейробиологи смогли исследовать роль, которую специфические гены и белки играют в функционировании нервной системы.
Например, в 1960-х годах Сеймур Бензер смог связать поведенческие изменения у плодовых мушек с конкретными генетическими мутациями, определив ключевые гены, экспрессируемые в нейронах, контролирующих поведение, например, локомоцию.
В тот же период времени Эрик Кандел продемонстрировал, что сложные процессы, такие как обучение, также имеют молекулярную основу. Используя морского моллюска Aplysia, он проанализировал экстракты нейронных тканей и включил внутриклеточную сигнальную молекулу циклического АМФ в путь, критически важный для обучения.
Затем, в 1980-х годах, сотрудники лаборатории Сёсаку Нумы были первыми, кто клонировал ключевые молекулы в функции нейронов, такие как потенциальный натриевый канал. Анализ функциональных доменов в этих больших мембранных белках с тех пор улучшил наше понимание того, как контроль движения ионов приводит к возбуждению нейронов.
Еще одно важное открытие в молекулярных механизмах нейронной коммуникации произошло в 1990-х годах, когда Томас Судхоф обнаружил, что ионы кальция изменяют форму белков, которые прикрепляют наполненные нейротрансмиттером везикулы к клеточной мембране, объясняя, как потенциалы действия приводят к точно синхронизированному высвобождению химических сигналов в синапс.
От нейрофизиологии до поведения, открытия в молекулярной нейробиологии улучшили наше понимание многих нейронаучных дисциплин.
Несмотря на эту продуктивную историю, еще многому предстоит научиться! Давайте рассмотрим некоторые вопросы, которые сегодня задаются в лабораториях.
Одна из областей исследований заключается в том, какие гены влияют на функцию нейронов. Например, известно, что нуклеотидные экспансии в определенных генах участвуют в нескольких заболеваниях, характеризующихся устойчивым ухудшением здоровья нейронов, таких как болезнь Хантингтона.
Другая исследуемая группа генов кодирует факторы транскрипции: белки, которые регулируют экспрессию определенных генов. Идентификация ДНК-мишеней специфических для нервной системы факторов транскрипции может дать нам лучшее представление о генетической программе, которая заставляет нас думать.
В качестве альтернативы нейробиологи могут задаться вопросом, как молекулы регулируют поведение нейронов. Например, они могут изучать молекулярный механизм, регулирующий движение ионов через клеточную мембрану, что приводит к распространению потенциалов действия. Исследования дали нам анестетики, такие как лидокаин, который блокирует определенные ионные каналы и останавливает передачу болевых сигналов в мозг.
В качестве альтернативы ученые могут исследовать места взаимодействия между нейронами, известные как синапс. Здесь они могут задаться вопросом, какие молекулы участвуют в сохранении целостности синапса и как эти связи могут быть восстановлены при болезненных состояниях.
Нейрональная пластичность — это способность нервной системы химически и физически адаптироваться в ответ на опыт. Некоторые исследования в этой области сосредоточены на зависящих от опыта морфологических изменениях в сложных нейронных структурах, известных как дендритные беседки, которые образуют синапсы через высокодинамичные структуры, называемые дендритными шипами. Других интересует, как опыт может изменить распределение рецепторов нейротрансмиттеров на синаптических мембранах, что может усилить сигнальную мощность синапса в феномене, известном как долгосрочная потенциация, или LTP.
Как видите, клеточные и молекулярные нейробиологи подходят к нейробиологии с микроскопической точки зрения, но спектр процессов, которые они изучают, обширен.
Теперь, когда вы знакомы с некоторыми интересными вопросами, которые задаются в лабораториях клеточной и молекулярной нейробиологии, давайте рассмотрим инструменты, доступные для ответа на них.
Во-первых, чтобы исследовать генетический контроль функции нейронов, ученые имеют в своем распоряжении несколько очень мощных методов. Например, микрочипы могут количественно оценить экспрессию огромного количества генов одновременно. Микрочип — это поверхность с прикрепленными к ней десятками тысяч фрагментов одноцепочечных «зондов» ДНК. Генетический материал, извлеченный из нейрона, связывается с зондами, а флуоресцентные маркеры используются для точной визуализации того, какие последовательности присутствуют в образце.
В качестве альтернативы, для количественной ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР используется оборудование, которое может косвенно измерять относительное количество конкретных транскриптов мРНК с помощью метода на основе ПЦР. Этот подход чрезвычайно полезен для определения уровней экспрессии отдельных генов.
И последнее, но не менее важное: трансгенная технология является важным инструментом для исследования функции генов в нервной системе. С помощью этого метода исследователи могут создавать животных с удаленными частями генома, известными как нокауты, или с модифицированными генами, вставленными в их генетический код, известными как трансгенные. Ткани нервной системы этих животных могут быть проанализированы различными способами, чтобы определить, как изменения в экспрессии генов влияют на клеточную функцию.
Чтобы изучить молекулярный контроль нейронной сигнализации, исследователи часто предпочитают изучать ткани мозга за пределами животного, либо в небольших кусочках ткани, либо в диссоциированных клетках, выращенных in vitro, называемых первичными нейрональными культурами. Одним из преимуществ этой упрощенной системы является возможность эффективно манипулировать экспрессией генов, представляющих интерес для нейронной сигнализации, путем трансфекции. Результаты этих генетических манипуляций затем можно наблюдать с помощью визуализации локализации белка, анализа морфологии клеток или электрофизиологических записей.
Наконец, впечатляющие достижения в технологии визуализации позволяют ученым изучать нейрональную пластичность новыми захватывающими способами. Например, исследователи могут использовать двухфотонную микроскопию для визуализации глубоких слоев живых тканей в мельчайших подробностях. После создания «окна» в черепе этот метод может быть использован для визуализации морфологии клеток мозга до и после того, как животные проходят через опыт, что позволяет исследователям увидеть, как выглядит обучение на нейронном уровне.
Инструменты визуализации также используются для исследования молекулярных компонентов нервной системы в сохранившихся тканях. Флуоресцентная микроскопия часто используется в сочетании с иммуногистохимией, при которой образцы окрашиваются флуоресцентными антителами, отмечающими клеточную локализацию специфических белков.
Рассмотрев оба важных вопроса и инструменты, используемые для ответа на них, давайте рассмотрим некоторые области применения исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии.
Во-первых, применяя методы микрочипов к небольшой популяции нейронов, исследователи могут изучить различия в экспрессии различных генов в конкретных подтипах нейронов. Здесь отдельные нейроны были выделены из сетчатки и извлечена клеточная РНК, что позволило исследователям профилировать экспрессию мРНК из клеток с различными функциональными и морфологическими характеристиками.
Молекулярные методы также могут быть применены для лучшего понимания реакции нервной системы на травму. Когда ганглии дорсальных корешков, или DRG, удаляются у взрослых мышей для первичной культуры нейронов, аксоны обязательно разрываются. Трансфектируя диссоциированные нейроны DRG с помощью конструкций сайленсинга генов, можно проверить влияние отдельных белков на повторный рост новых аксонов.
Специализированные методы визуализации могут быть использованы для изучения того, как белки, такие как рецепторы нейротрансмиттеров, транспортируются к синаптической мембране и обратно. В этом эксперименте культивируемые нейроны были трансфицированы геном, кодирующим мембранный белок с флуоресцентной меткой. С помощью конфокального микроскопа небольшие участки мембраны были затем фотообесцвечены, что означает, что флуорофоры в этой области были разрушены. При использовании здесь схемы обесцвечивания прогрессивное восстановление флуоресценции, или FRAP, отражает транспорт новых флуоресцентных белков в плазматическую мембрану. Скорость, с которой происходит это движение, может быть количественно определена и сравнена во многих экспериментальных условиях.
Вы только что посмотрели введение JoVE в клеточную и молекулярную нейробиологию. В этом видео мы обсудили исторические открытия, которые сделали клеточную и молекулярную нейробиологию той областью, которой она является сегодня, некоторые ключевые вопросы в этой области и методы, используемые для ответа на них.
Как всегда, спасибо за просмотр JoVE Science Education!
Простейшие рефлексы на самые возвышенные эмоциональные переживания коренятся в молекулярных, генетических и клеточных структурах мозга. Являясь одной из новейших областей нейробиологии, клеточная и молекулярная нейробиология использует молекулярную биологию для изучения того, как гены, сигнальные молекулы и клеточная морфология влияют на нервную систему
В этом видео будут представлены знаковые открытия в этой области, затронуты ключевые вопросы исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии и, наконец, продемонстрируются несколько известных методов, которые могут быть применены для ответа на эти вопросы.
Давайте начнем с того, что оглянемся назад на научные корни этой относительно молодой области.
До появления молекулярных методов анатомы и клеточные биологи доминировали в ранней истории нейробиологии.
Однако в 1930-х годах приток физиков, химиков и теоретиков в ряды биологов положил начало молекулярной революции, кульминацией которой стало открытие Уотсоном и Криком структуры ДНК и формализация центральной догмы, объясняющей, как ДНК кодирует белки, выступающие в качестве функциональных единиц клеток. Впервые нейробиологи смогли исследовать роль, которую специфические гены и белки играют в функционировании нервной системы.
Например, в 1960-х годах Сеймур Бензер смог связать поведенческие изменения у плодовых мушек с конкретными генетическими мутациями, определив ключевые гены, экспрессируемые в нейронах, контролирующих поведение, например, локомоцию.
В тот же период времени Эрик Кандел продемонстрировал, что сложные процессы, такие как обучение, также имеют молекулярную основу. Используя морского моллюска Aplysia, он проанализировал экстракты нейронных тканей и включил внутриклеточную сигнальную молекулу циклического АМФ в путь, критически важный для обучения.
Затем, в 1980-х годах, сотрудники лаборатории Сёсаку Нумы были первыми, кто клонировал ключевые молекулы в функции нейронов, такие как потенциальный натриевый канал. Анализ функциональных доменов в этих больших мембранных белках с тех пор улучшил наше понимание того, как контроль движения ионов приводит к возбуждению нейронов.
Еще одно важное открытие в молекулярных механизмах нейронной коммуникации произошло в 1990-х годах, когда Томас Судхоф обнаружил, что ионы кальция изменяют форму белков, которые прикрепляют наполненные нейротрансмиттером везикулы к клеточной мембране, объясняя, как потенциалы действия приводят к точно синхронизированному высвобождению химических сигналов в синапс.
От нейрофизиологии до поведения, открытия в молекулярной нейробиологии улучшили наше понимание многих нейронаучных дисциплин.
Несмотря на эту продуктивную историю, еще многому предстоит научиться! Давайте рассмотрим некоторые вопросы, которые сегодня задаются в лабораториях.
Одна из областей исследований заключается в том, какие гены влияют на функцию нейронов. Например, известно, что нуклеотидные экспансии в определенных генах участвуют в нескольких заболеваниях, характеризующихся устойчивым ухудшением здоровья нейронов, таких как болезнь Хантингтона.
Другая исследуемая группа генов кодирует факторы транскрипции: белки, которые регулируют экспрессию определенных генов. Идентификация ДНК-мишеней специфических для нервной системы факторов транскрипции может дать нам лучшее представление о генетической программе, которая заставляет нас думать.
В качестве альтернативы нейробиологи могут задаться вопросом, как молекулы регулируют поведение нейронов. Например, они могут изучать молекулярный механизм, регулирующий движение ионов через клеточную мембрану, что приводит к распространению потенциалов действия. Исследования дали нам анестетики, такие как лидокаин, который блокирует определенные ионные каналы и останавливает передачу болевых сигналов в мозг.
В качестве альтернативы ученые могут исследовать места взаимодействия между нейронами, известные как синапс. Здесь они могут задаться вопросом, какие молекулы участвуют в сохранении целостности синапса и как эти связи могут быть восстановлены при болезненных состояниях.
Нейрональная пластичность — это способность нервной системы химически и физически адаптироваться в ответ на опыт. Некоторые исследования в этой области сосредоточены на зависящих от опыта морфологических изменениях в сложных нейронных структурах, известных как дендритные беседки, которые образуют синапсы через высокодинамичные структуры, называемые дендритными шипами. Других интересует, как опыт может изменить распределение рецепторов нейротрансмиттеров на синаптических мембранах, что может усилить сигнальную мощность синапса в феномене, известном как долгосрочная потенциация, или LTP.
Как видите, клеточные и молекулярные нейробиологи подходят к нейробиологии с микроскопической точки зрения, но спектр процессов, которые они изучают, обширен.
Теперь, когда вы знакомы с некоторыми интересными вопросами, которые задаются в лабораториях клеточной и молекулярной нейробиологии, давайте рассмотрим инструменты, доступные для ответа на них.
Во-первых, чтобы исследовать генетический контроль функции нейронов, ученые имеют в своем распоряжении несколько очень мощных методов. Например, микрочипы могут количественно оценить экспрессию огромного количества генов одновременно. Микрочип — это поверхность с прикрепленными к ней десятками тысяч фрагментов одноцепочечных «зондов» ДНК. Генетический материал, извлеченный из нейрона, связывается с зондами, а флуоресцентные маркеры используются для точной визуализации того, какие последовательности присутствуют в образце.
В качестве альтернативы, для количественной ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР используется оборудование, которое может косвенно измерять относительное количество конкретных транскриптов мРНК с помощью метода на основе ПЦР. Этот подход чрезвычайно полезен для определения уровней экспрессии отдельных генов.
И последнее, но не менее важное: трансгенная технология является важным инструментом для исследования функции генов в нервной системе. С помощью этого метода исследователи могут создавать животных с удаленными частями генома, известными как нокауты, или с модифицированными генами, вставленными в их генетический код, известными как трансгенные. Ткани нервной системы этих животных могут быть проанализированы различными способами, чтобы определить, как изменения в экспрессии генов влияют на клеточную функцию.
Чтобы изучить молекулярный контроль нейронной сигнализации, исследователи часто предпочитают изучать ткани мозга за пределами животного, либо в небольших кусочках ткани, либо в диссоциированных клетках, выращенных in vitro, называемых первичными нейрональными культурами. Одним из преимуществ этой упрощенной системы является возможность эффективно манипулировать экспрессией генов, представляющих интерес для нейронной сигнализации, путем трансфекции. Результаты этих генетических манипуляций затем можно наблюдать с помощью визуализации локализации белка, анализа морфологии клеток или электрофизиологических записей.
Наконец, впечатляющие достижения в технологии визуализации позволяют ученым изучать нейрональную пластичность новыми захватывающими способами. Например, исследователи могут использовать двухфотонную микроскопию для визуализации глубоких слоев живых тканей в мельчайших подробностях. После создания «окна» в черепе этот метод может быть использован для визуализации морфологии клеток мозга до и после того, как животные проходят через опыт, что позволяет исследователям увидеть, как выглядит обучение на нейронном уровне.
Инструменты визуализации также используются для исследования молекулярных компонентов нервной системы в сохранившихся тканях. Флуоресцентная микроскопия часто используется в сочетании с иммуногистохимией, при которой образцы окрашиваются флуоресцентными антителами, отмечающими клеточную локализацию специфических белков.
Рассмотрев оба важных вопроса и инструменты, используемые для ответа на них, давайте рассмотрим некоторые области применения исследований в области клеточной и молекулярной нейробиологии.
Во-первых, применяя методы микрочипов к небольшой популяции нейронов, исследователи могут изучить различия в экспрессии различных генов в конкретных подтипах нейронов. Здесь отдельные нейроны были выделены из сетчатки и извлечена клеточная РНК, что позволило исследователям профилировать экспрессию мРНК из клеток с различными функциональными и морфологическими характеристиками.
Молекулярные методы также могут быть применены для лучшего понимания реакции нервной системы на травму. Когда ганглии дорсальных корешков, или DRG, удаляются у взрослых мышей для первичной культуры нейронов, аксоны обязательно разрываются. Трансфектируя диссоциированные нейроны DRG с помощью конструкций сайленсинга генов, можно проверить влияние отдельных белков на повторный рост новых аксонов.
Специализированные методы визуализации могут быть использованы для изучения того, как белки, такие как рецепторы нейротрансмиттеров, транспортируются к синаптической мембране и обратно. В этом эксперименте культивируемые нейроны были трансфицированы геном, кодирующим мембранный белок с флуоресцентной меткой. С помощью конфокального микроскопа небольшие участки мембраны были затем фотообесцвечены, что означает, что флуорофоры в этой области были разрушены. При использовании здесь схемы обесцвечивания прогрессивное восстановление флуоресценции, или FRAP, отражает транспорт новых флуоресцентных белков в плазматическую мембрану. Скорость, с которой происходит это движение, может быть количественно определена и сравнена во многих экспериментальных условиях.
Вы только что посмотрели введение JoVE в клеточную и молекулярную нейробиологию. В этом видео мы обсудили исторические открытия, которые сделали клеточную и молекулярную нейробиологию той областью, которой она является сегодня, некоторые ключевые вопросы в этой области и методы, используемые для ответа на них.
Как всегда, спасибо за просмотр JoVE Science Education!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is cellular and molecular neuroscience?
Cellular and molecular neuroscience is a subdiscipline that leverages molecular biology to explore how genes, signaling molecules, and cellular morphology influence the nervous system. It combines techniques from molecular biology with neuroscience to understand normal brain function and pathological conditions. This field emerged in the 1930s when physicists, chemists, and theoreticians joined biologists, enabling investigation of specific genes and proteins in nervous system function.
Q2: How do microarrays measure gene expression in neurons?
Microarrays are surfaces with tens of thousands of single-stranded DNA probes attached. Genetic material extracted from neurons binds to these probes, and fluorescent markers visualize which sequences are present. This technique allows simultaneous quantification of expression across a huge number of genes, making it powerful for profiling neuronal subtypes and identifying differences in gene expression patterns.
Q3: What role do calcium ions play in neurotransmitter release?
Calcium ions alter the shape of proteins that anchor neurotransmitter-filled vesicles to the cell membrane. This discovery by Thomas Sudhof in the 1990s explained how action potentials lead to precisely timed release of chemical signals into the synapse. Understanding this molecular mechanism revealed the link between neuronal electrical activity and chemical communication between neurons.
Q4: How do researchers study neuronal plasticity using imaging?
Two-photon microscopy allows visualization of deep layers in living tissues with great detail. After creating a window in the skull, researchers can image brain cell morphology before and after animals undergo experiences, revealing what learning looks like at the neuronal level. This imaging approach enables direct observation of experience-dependent changes in dendritic arbors and synaptic structures.
Q5: What is transfection and why is it useful in neuronal research?
Transfection is a method to efficiently manipulate gene expression in neurons by introducing modified genetic material into cells. Researchers use transfection to study molecular control of neuronal signaling in primary neuronal cultures grown in vitro. Results can be observed through protein localization visualization, cell morphology analysis, or electrophysiological recordings to determine how genetic changes affect cellular function.
Q6: How do voltage-gated sodium channels relate to neuronal firing?
Voltage-gated sodium channels are key molecules in neuron function that control ion movements across the cell membrane. When these channels were first cloned in the 1980s, analysis of their functional domains improved understanding of how ion movement regulation leads to neuron firing. This discovery was foundational to understanding the molecular basis of neuronal electrical activity and action potential propagation.
Q7: What does FRAP reveal about protein transport in neurons?
FRAP, or fluorescence recovery after photobleaching, measures protein transport to and from synaptic membranes. Cultured neurons are transfected with fluorescently tagged membrane proteins, then small membrane regions are photobleached to destroy fluorophores. Progressive fluorescence recovery reflects transport of new proteins into the plasma membrane, and the rate of movement can be quantified and compared across experimental conditions.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:53
The History of Molecular Neuroscience
3:26
Key Questions
5:49
Prominent Methods
9:02
Applications
10:55
Summary