Использование plusTipTracker Программное обеспечение для измерения микротрубочек Динамика в Xenopus Хепориз Шишки роста
7 сентября 2014 г.
MATLAB, открытой пакет программного обеспечения источник, plusTipTracker, может быть использована для анализа ряд изображений флуо- меченных + Советы для количественной динамики микротрубочек.
Целью данной процедуры является получение количественной информации о микротрубочках плюс отслеживающий конец белка или динамика плюсового кончика и живых конусах роста с помощью программного комплекса плюс трекер зонда. Здесь мы описываем этапы анализа изображений динамики EB one GFP и культивируемых конусов роста XUS lavis, но аналогичный протокол может быть использован и для других типов клеток после получения изображений с высоким разрешением в реальном времени помеченных EB one и культивируемых конусов эмбрионального роста. Первым шагом в процедуре является использование команды плюс подсказка, получение треков для обнаружения комет EB one GFP, связывание комет в треки и определение параметров динамики микротрубочек.
Второй шаг заключается в использовании команды плюс подсказка C tracks для визуализации дорожек микротрубочек, наложенных на изображения конуса роста. Заключительным шагом является использование анализа групп плюсовых наконечников для анализа и сравнения параметров трека микротрубочек групп фильмов. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как использование отслеживания рук для анализа отдельных следов плюс наконечник, заключается в том, что этот метод позволяет быстро и автоматически обнаруживать, отслеживать, визуализировать и анализировать.
Первым шагом в анализе изображений является обнаружение комет EB one GFP, связывание комет в треки и определение параметров динамики микротрубочек. Это получается с помощью команды плюс подсказка. Получайте треки до анализа изображений.
Преобразуйте каждый цейтраферный фильм в последовательность файлов изображений в формате TIFF и сохраняйте каждую серию в отдельной папке под названием «Изображения». Обратите внимание, что изображения чувствительны к регистру. Чтобы начать анализ, откройте приложение MATLAB и введите плюс tip get tracks в командном окне.
Это приведет к появлению нового диалогового окна. Нажмите кнопку, настройте новые проекты и выберите одну или несколько из предыдущих серий изображений TIFF, выбрав соответствующую папку изображений. По завершении этого шага будет создана директория File.
Нажмите, хорошо. После отображения первого изображения используйте мышь, чтобы щелкнуть мышью и создать многоугольник. Затем охватывает всю конус роста.
Дважды щелкните мышью, чтобы замкнуть многоугольник. Диалоговое окно появится, если на изображении есть еще один конус роста. Для анализа выберите Да.
В противном случае выберите «нет». Следующий шаг – выбор проектов, которые будут сразу же проанализированы. Нажмите на выбор проектов и выберите папку.
Для анализа списка, выберите липкий экран. Выберите проекты в левой части экрана и переместите их в правую сторону. Нажмите, хорошо.
Выберите местоположение для сохранения списка проектов и нажмите «Сохранить», выберите «Обнаружение», «Отслеживание» и «Постобработка». Как только эти настройки будут сделаны, правая часть диалогового окна станет настраиваемой. Заполните настройки постобработки.
В зависимости от желаемых конкретных настроек съемки нажмите кнопку «Пуск». Затем программное обеспечение выполнит все введенные шаги. В командном окне отображается предполагаемое время, оставшееся для каждой функции, и будет указано, когда выполнение шага будет завершено.
Теперь, когда дорожки микротрубок определены, функция плюс дорожки наконечника C используется для визуализации следов и отображения дорожек микротрубок, наложенных на изображения конусов роста. Это получается с помощью команды plus tip C tracks type plus tip C tracks в командном окне. После загрузки диалогового окна нажмите на выбор проекта.
Выберите родительскую директорию, содержащую проект для визуализации, и нажмите на кнопку «Выбрать папку». Как только появится окно, выберите файл для визуализации и нажмите на него. Хорошо, далее нажмите на «Выбрать сохраненный ROI», перейдите в ту же папку с областью интереса, что и выбранная на предыдущем шаге, и выберите файл с именем R-O-I-Y-X.
Нажмите на Select Output Director, чтобы указать, куда MATLAB будет сохранять файлы визуализации трека, а затем выберите make track movie. Появится экран со всеми треками. Плюс чаевые получают треки, рассчитанные на основе комментариев к плюсовым чаевым.
Этот шаг сохраняет временной ряд дорожки в формате фильма. Конечная функция используется для создания групп видеороликов для анализа и сравнения параметров дорожки микротрубок. Это получается с помощью анализа группы команд и чаевых.
Один раз плюс подсказка для получения треков была запущена для нескольких фильмов, и различные подмножества данных готовы к сравнению. Введите плюс анализ группы чаевых в командном окне Чтобы вручную выбрать группы для сравнения, сначала снимите выбор автогруппы из иерархии. Затем нажмите на выбранные проекты.
Перейдите к родительским каталогам, содержащим все папки ROI. Чтобы проанализировать список, выберите Окно графического интерфейса. Выберите все проекты для включения в группы в левой части экрана и переместите их в правую сторону.
Нажмите, хорошо. Затем выберите место для сохранения списка проектов и нажмите на кнопку «Сохранить», появится окно. Нажмите на.
Ладно, и отобразится липкое окно выбора списка. Опять же, выберите только те файлы, которые соответствуют первой группе, которую следует собрать, и нажмите на нее. Хорошо. Введите название группы и нажмите «Хорошо».
Появится окно, ответьте соответствующим образом и продолжите выбор групп. Затем выберите место для сохранения списка групп и нажмите «Сохранить». Нажмите на кнопку «Выбрать выходной каталог», чтобы выбрать, где будут храниться выходные папки.
Наконец, выберите, какой тип группового анализа следует проводить. Здесь мы выбираем данные пула из всех ячеек и групп. Нажмите на кнопку «Сравнить группы».
На этом изображении отображаются параметры динамики микротрубок, полученные из функции плюс git-треки tip. В этом видеоролике демонстрируются дорожки микротрубочек, полученные с помощью функции плюс дорожки наконечника C. Наконец, на этом изображении показаны параметры микротрубочек, полученные в результате анализа функции и группы зонда.
Использование приложения для работы с электронными таблицами. Эти параметры, полученные из различных групп фильмов, также могут быть изучены в виде ящичковых диаграмм с помощью программы обработки A. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать трекер plus tip для получения количественной информации о динамике микротрубочек и конусов роста и живых конусах роста с помощью функций plus tip git tracks plus tip c tracks и plus tip group analysis.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается использование программного пакета plusTipTracker на базе MATLAB для анализа динамики микротрубочек с помощью флуоресцентно-меченных +TIP-белков. Описанная процедура представляет собой систематический подход к количественной оценке поведения белков, отслеживающих плюс-концы микротрубочек, в живых конусах роста.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Динамика микротрубочек
Теоретические основы
- Микротрубочки играют ключевую роль в структуре и функционировании клеток.
- +TIP — это белки, которые связываются с растущими концами микротрубочек.
- Количественный анализ динамики +TIP необходим для понимания клеточных процессов.
- Существующие методы отслеживания микротрубочек могут быть трудоемкими и менее эффективными.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол анализа динамики микротрубочек с помощью программы plusTipTracker.
- Углубить понимание поведения +TIP-белков в живых клетках.
- Продемонстрировать преимущества автоматизированного трекинга по сравнению с ручными методами.
Используемые методы
- Использование команды plusTip, get tracks для обнаружения «комет» EB1-GFP.
- Объединение «комет» в треки для определения параметров динамики микротрубочек.
- Визуализация треков микротрубочек с помощью команды plusTip C tracks.
- Групповой анализ параметров треков микротрубочек по нескольким видеозаписям.
Основные результаты
- Были реализованы автоматическое детектирование и отслеживание динамики микротрубочек.
- Методы визуализации позволили получить четкое представление о поведении микротрубочек.
- Групповой анализ обеспечил возможность проведения сравнительных исследований при различных условиях.
- Данный метод оказался более быстрым и эффективным, чем традиционные методы отслеживания.
Выводы
- plusTipTracker является ценным инструментом для изучения динамики микротрубочек.
- Автоматизированный подход повышает точность и эффективность анализа.
- Данный протокол может быть адаптирован для различных типов клеток и условий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка динамики микротрубочек в конусах роста нейронов дает представление о механизмах аксонального наведения и формирования синапсов — процессах, имеющих значение для моделей нарушений нейропсихического развития. Автоматизированный анализ траекторий «комет» +TIP позволяет проводить высокопроизводительный скрининг соединений, влияющих на регуляцию цитоскелета, что способствует валидации мишеней в рамках исследовательских циклов в области нейробиологии. Данный подход снижает аналитическую предвзятость и увеличивает пропускную способность по сравнению с ручным отслеживанием, повышая прогностическую достоверность исследований взаимодействия с мишенями на ранних стадиях.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать динамику полимеризации микротрубочек в качестве функционального показателя для мишеней, регулирующих рост или стабильность аксонов.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированные количественные параметры (скорость роста, частота пауз, частота катастроф) для согласованной оценки фенотипа мишеней при анализе библиотек соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать воспроизводимые многопараметрические данные о поведении микротрубочек, подходящие для миниатюризации и автоматизации анализа в 96- и 384-луночных форматах.
- Практическая ценность: Способствует стандартизации анализа между лабораториями за счет определения четких критериев выбора ROI, параметров трекинга и порогов группового анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает фенотипы динамики микротрубочек in vitro с механизмами, имеющими значение для заболеваний в моделях нейроразвития или нейродегенерации.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от первичных культур нейронов к органотипическим срезам или валидации in vivo благодаря консервативной методологии отслеживания +TIP-белков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод applicable на этапе раннего поиска лекарственных средств, когда количественный анализ фенотипов цитоскелета используется для выбора мишени перед идентификацией ведущих соединений и доклиническим тестированием эффективности.
- Открытие новых биологических мишеней: позволяет проверить гипотезы относительно киназ, фосфатаз или микротрубочко-ассоциированных белков-мишеней посредством прямого измерения динамики «комет» +TIP в живых конусах роста.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу нормализованных данных (плотность комет, длина трека, распределение скоростей), что позволяет рассчитывать Z'-фактор и подтверждать наличие хитов.
- Аналитика: предоставляет статистические сравнения на уровне групп (среднее значение, дисперсия, сдвиги распределения), необходимые для оценки эффектов соединений в биологических повторностях.
- Трансляционные исследования: связывает фенотипы цитоскелета с анализами роста аксонов или формирования синапсов, что соответствует доклиническим функциональным конечным точкам.
- Корпоративное повторное использование: создает централизованную аналитическую платформу на базе MATLAB, применимую к различным типам клеток (нейронам, фибробластам, раковым линиям), экспрессирующим флуоресцентные +TIP.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов модуляции мишени за счет снижения вариабельности, присущей ручному отслеживанию, и обеспечения возможности обнаружения тонких динамических сдвигов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря автоматизированному обнаружению «комет», стандартизированным алгоритмам отслеживания и пакетной обработке серий таймлапс-изображений.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя многопараметрические профили цитоскелета на более ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе количественной степени выраженности фенотипа микротрубочек и величины вызванного соединением восстановления.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток, работе в среде MATLAB и мечении флуоресцентными белками (например, EB1-GFP) первичных культур нейронов.
- Зависит от наличия систем таймлапс-съемки с высоким разрешением и низкой фототоксичностью, способных фиксировать динамику комет +TIP с интервалом 1–2 секунды.
- Необходима межкомандная стандартизация определения ROI (периметр конуса роста), параметров трекинга (расстояние связывания, пропуск кадров) и фильтров постобработки.
- Включает учет адаптации к различным морфологиям клеток (например, конусы роста в сравнении с аксональными стволами) и разным уровням экспрессии +TIP в модельных системах.
- Ограничено требованием к наличию детектируемых и устойчивых комет +TIP; метод может быть неприменим в условиях крайне нестабильной или редкой полимеризации микротрубочек.
