1.11: Первичные культуры нейронов

Мозг является одним из самых сложных органов в организме, поэтому нейробиологам часто требуется более простая система для проведения экспериментальных манипуляций и наблюдений. Культивирование клеток является одной из таких систем, которая обеспечивает легкий доступ к живым нейронам. В целом, культивирование клеток включает в себя выращивание их в специальных растворах, называемых культуральными средами, в стерильной, контролируемой среде. Обычно это теплый инкубатор. Первичная культура – это культура, которая производится из ткани, препарированной организмом. Различные типы первичных нейронных культур могут быть получены из различных животных, стадий развития и тканей нервной системы.

Это видео познакомит вас с методом получения первичных нейронных культур и некоторыми экспериментами, в которых обычно используются эти клетки.

Многие животные модели, важные для исследований в области нейробиологии, могут быть использованы для получения первичных культур нейронов. С мышами и крысами? Два наиболее часто используемых млекопитающих в биомедицинских исследованиях ? Нейронная ткань эмбрионов, новорожденных щенков и взрослых особей может быть препарирована для культивирования. Эмбрионы и перинатальные щенки обычно предпочтительны, поскольку клетки мозга незрелые и менее восприимчивы к повреждениям.

Различные ткани нервной системы могут быть выделены и использованы для производства различных типов первичных нейронных культур. Например, можно препарировать определенные части мозга, такие как мозжечок, кора и гиппокамп. Спинной мозг или компоненты периферической нервной системы, такие как ганглии заднего корешка, также могут быть рассечены и культивированы для выращивания определенных типов нейронов.

Независимо от источника ткани, общий метод получения первичных культур нейронов можно свести к нескольким основным этапам: диссекция, диссоциация, покрытие и поддержание.

Давайте начнем углубленный обзор этих шагов с первого: Вскрытие. При подготовке к вскрытию и культивированию стерильность имеет решающее значение для предотвращения загрязнения культур. Инструменты должны быть стерилизованы спиртом, а для удаления переносимых по воздуху загрязнений часто используется ламинарный вытяжной колпак.

Для культивирования нейронов грызунов ткань только что усыпленных животных должна быть удалена в холодный буферный раствор соли. С помощью препарирующего микроскопа более мелкие участки ткани ? Например, гиппокамп? может быть тщательно изолирован для дальнейшей обработки.

Далее необходимо разбить образец на клеточные компоненты в процессе, известном как диссоциация. Рассеченная ткань сначала измельчается с помощью скальпеля или ножниц. Полученные кусочки ткани затем перекладываются в новую емкость. Затем добавляется протеолитический фермент, такой как трипсин или папаин, для переваривания белков внеклеточного матрикса, которые связывают клетки вместе. После короткой инкубации в теплом инкубаторе или на водяной бане кусочки ткани аккуратно промывают буфером для удаления ферментов.

Размягченные кусочки ткани теперь могут быть диссоциированы с помощью растирания, которое включает в себя многократное пропускание ткани через пипетку, чтобы клетки высвобождались в одноклеточную суспензию. На этом этапе клетки могут быть подсчитаны на концентрацию и проверены на жизнеспособность с помощью красителей, таких как Трипановый синий, который помогает определить, насколько суспензию следует разбавить для успешного роста.

Наконец-то нейроны готовы к культуре! Давайте рассмотрим некоторые важные меры, которые необходимо предпринять, чтобы сохранить их живыми и здоровыми. Очень важен состав питательных сред, которые используются для выращивания нейронов. В среду обычно добавляют специальные добавки, которые поддерживают выживание и рост нейронов. Другие добавки могут включать препараты, которые подавляют деление ненейрональных клеток, таких как глиальные клетки.

После того, как суспензия нейронных клеток смешивается со средой, клетки готовы к размещению в желаемых контейнерах. Это могут быть тарелки и тарелки для культур или стеклянные покровные листы, помещенные внутрь этих контейнеров. Поскольку нейроны не могут расти непосредственно на стекле, покровные стекла обрабатываются заранее, чтобы создать лучшие поверхности для прикрепления и роста клеток. Эти методы лечения могут включать покрытие синтетическими белками внеклеточного матрикса; например, полилизин и ламинин; или травление кислотой для придания шероховатости поверхности.

После нанесения пластин нейроны выращиваются в теплом, увлажненном инкубаторе. Рост нейронных процессов может наблюдаться в течение от нескольких часов до нескольких дней. Для поддержания культур часть питательных сред заменяется свежей средой примерно раз в неделю. Как правило, первичные культуры нейронов используются для экспериментов в период от нескольких дней до нескольких недель после осаждения.

Теперь, когда у вас есть нейроны, растущие в культурах, что вы можете сделать с этими клетками?

Одним из основных методов, обычно применяемых к культурам нейронов, является генетическая манипуляция путем трансфекции или вирусной трансдукции. Кодирующий генетический материал, например, мутантный белок, может быть введен в культивируемые нейроны для изменения функции нейронов. В качестве альтернативы, трансфекция с помощью двухцепочечной РНК является эффективным методом блокирования экспрессии белка. Доступность нескольких методов и реагентов для генетических манипуляций делает эту работу особенно ценным приложением для решения широкого круга исследовательских вопросов.

В качестве примера можно привести вопрос, который можно решить с помощью трансфекции в культурах нейронов: как и где определенные белки или белковые комплексы доставляются в различные морфологические структуры нейрона? Чтобы получить ответ, нейроны трансфицируются ДНК, кодирующей интересующий белок, который может быть слит с флуоресцентным белком, таким как зеленый флуоресцентный белок или GFP. Затем можно контролировать характер движения и локализацию флуоресцентно меченного белка с помощью визуализации в реальном времени. Этот метод может быть использован для изучения, например, транспортировки рецепторов нейротрансмиттеров на поверхность клетки.

Первичные культуры нейронов также очень полезны для электрофизиологических исследований, в которых электрическая активность отдельных клеток может быть измерена с помощью микроэлектродов. Один слой нейронов в культуре означает, что отдельные клетки легко поддаются воздействию, а такие манипуляции, как фармакологическое лечение, применяются быстро и равномерно. Например, влияние тестового соединения на активность одного нейрона может быть измерено с помощью техники патч-зажима в культивируемых нейронах.

Вы только что посмотрели введение JoVE в первичные нейронные культуры. В этом видео мы продемонстрировали, как подготавливаются эти культуры и для каких типов экспериментов они обычно используются. Первичные нейрональные культуры могут быть получены из широкого спектра тканевых источников, как правило, с использованием метода, включающего диссекцию, диссоциацию в клеточную суспензию и выращивание в питательных средах в инкубаторах.

Спасибо за просмотр!