Первичные культуры нейронов

Мозг является одним из самых сложных органов в организме, поэтому нейробиологам часто требуется более простая система для проведения экспериментальных манипуляций и наблюдений. Культивирование клеток представляет собой такую систему, которая обеспечивает легкий доступ к живым нейронам. В целом, культивирование клеток заключается в их выращивании в специальных растворах, называемых питательными средами, в стерильной, контролируемой среде — обычно в теплом инкубаторе. Первичная культура — это культура, полученная из тканей, выделенных из организма. Различные типы первичных нейрональных культур могут быть созданы на основе тканей различных животных, стадий развития и отделов нервной системы.

В данном видео будет представлено введение в метод получения первичных нейрональных культур, а также описаны некоторые эксперименты, в которых обычно используются эти клетки.

Многие животные модели, имеющие важное значение для нейробиологических исследований, могут быть использованы для подготовки первичных культур нейронов. При работе с мышами и крысами — двумя из наиболее часто используемых млекопитающих в биомедицинских исследованиях — для культивирования могут быть выделены ткани нервной системы эмбрионов, новорожденных детенышей и взрослых особей. Как правило, предпочтение отдается эмбрионам и перинатальным детенышам, так как клетки их мозга незрелые и менее подвержены повреждениям.

Для получения различных типов первичных культур нейронов можно изолировать и использовать разные ткани нервной системы. Например, могут быть выделены определенные области головного мозга, такие как мозжечок, кора и гиппокамп. Также могут быть выделены и культивированы спинной мозг или компоненты периферической нервной системы, например, ганглии задних корешков, для выращивания специфических типов нейронов.

Независимо от источника ткани, общий метод получения первичных культур нейронов можно свести к нескольким основным этапам: препарирование, диссоциация, посев и поддержание культуры.

Приступим к детальному разбору этих этапов, начиная с первого: диссекции. При подготовке к диссекции и культивированию критически важно соблюдать стерильность, чтобы предотвратить контаминацию культур. Инструменты необходимо стерилизовать спиртом; для удаления частиц загрязнения из воздуха часто используют ламинарный шкаф.

Для культивирования нейронов грызунов ткани следует извлекать из свежеэвтаназированных животных в холодный буферный солевой раствор. С помощью диссекционного микроскопа можно аккуратно изолировать отдельные части ткани, например гиппокампы, для дальнейшей обработки.

Затем необходимо разбить образец на клеточные компоненты в процессе, называемом диссоциацией. Сначала препарированную ткань измельчают с помощью скальпеля или ножниц. Полученные фрагменты ткани переносят в новую емкость. Затем добавляют протеолитический фермент, такой как трипсин или папаин, для расщепления белков внеклеточного матрикса, которые удерживают клетки вместе. После короткой инкубации в термостате или на водяной бане фрагменты ткани осторожно промывают буфером для удаления ферментов.

Размягченные фрагменты ткани теперь можно диссоциировать путем тритурации, которая заключается в многократном пропускании ткани через пипетку до получения суспензии единичных клеток. На этом этапе можно подсчитать концентрацию клеток и проверить их жизнеспособность с помощью таких красителей, как Trypan blue, что поможет определить степень разведения суспензии для успешного культивирования.

Наконец, нейроны готовы к культивированию! Давайте рассмотрим некоторые важные меры, которые необходимо предпринять для поддержания их жизнеспособности и здоровья. Состав питательной среды, используемой для выращивания нейронов, имеет критическое значение. В среду обычно добавляют специальные добавки, поддерживающие выживание и рост нейронов. Другими добавками могут быть препараты, ингибирующие деление ненейрональных клеток, таких как глиальные клетки.

После смешивания суспензии нейрональных клеток со средой клетки готовы к посеву в подходящие контейнеры. Ими могут быть чашки и планшеты для культивирования или стеклянные покровные стекла, помещенные внутрь этих контейнеров. Поскольку нейроны не могут расти непосредственно на стекле, покровные стекла предварительно обрабатывают для создания оптимальной поверхности для прикрепления и роста клеток. Такая обработка может включать покрытие белками синтетического внеклеточного матрикса, например, полилизином и ламинином, или кислотное травление для создания шероховатости поверхности.

После посева нейроны выращивают в теплом увлажненном инкубаторе. Рост нейрональных отростков можно наблюдать в течение нескольких часов или дней. Для поддержания культур часть питательной среды заменяют свежей примерно раз в неделю. Как правило, первичные культуры нейронов используют для экспериментов в период от нескольких дней до нескольких недель после посева.

Теперь, когда у вас есть растущие в культуре нейроны, что можно сделать с этими клетками?

Одним из базовых методов, часто применяемых к культурам нейронов, является генетическая манипуляция посредством трансфекции или вирусной трансдукции. Генетический материал, кодирующий, например, мутантный белок, может быть введен в культивируемые нейроны для изменения их функций. В качестве альтернативы, трансфекция двухцепочечной РНК является эффективным методом блокирования экспрессии белков. Наличие множества методов и реагентов для генетических манипуляций делает этот подход особенно ценным для решения широкого спектра исследовательских задач.

Примером вопроса, который можно изучить с помощью трансфекции в культурах нейронов, является: как и куда транспортируются определенные белки или белковые комплексы в различные морфологические структуры нейрона? Чтобы найти ответ, нейроны трансфицируют ДНК, кодирующей интересующий белок, который может быть слит с флуоресцентным белком, таким как зеленый флуоресцентный белок или GFP. Затем с помощью прижизненной визуализации можно отслеживать характер перемещения и локализацию белка с флуоресцентной меткой. Этот метод может быть использован, например, для изучения транспорта рецепторов нейромедиаторов к поверхности клетки.

Первичные культуры нейронов также очень полезны для электрофизиологических исследований, в которых электрическая активность отдельных клеток измеряется с помощью микроэлектродов. То, что нейроны в культуре располагаются одним слоем, означает, что отдельные клетки легкодоступны для воздействия, а такие манипуляции, как фармакологическое лечение, применяются быстро и равномерно. Например, с помощью метода patch-clamp в культивируемых нейронах можно измерить влияние исследуемого соединения на активность одного нейрона.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по первичным культурам нейронов. В этом ролике мы продемонстрировали способ подготовки таких культур и типы экспериментов, в которых они обычно используются. Первичные культуры нейронов могут быть получены из самых разных тканей, как правило, с помощью метода, включающего препарирование, диссоциацию в клеточную суспензию и культивирование в питательных средах в инкубаторах.

Спасибо за просмотр!