Методы трансфекции нейронов

Трансфекция — перенос генетического материала в клетки млекопитающих — является ценным инструментом, позволяющим ученым генетически модифицировать нейроны и нейрональную ткань. Уникальные свойства этих хрупких клеток затрудняют процесс трансфекции и требуют применения специализированных методов.

В данном видео будут рассмотрены принципы трансфекции нейронов и представлены стратегии, обычно используемые для этих клеток, включая нуклеофекцию, биолистическую трансфекцию и вирусную трансдукцию. В завершение мы обсудим применение методов трансфекции в клеточных и молекулярных нейробиологических исследованиях.

Начнем с обзора принципов трансфекции. Хотя генетический материал можно доставить в непосредственную близость к культивируемой клетке, добавив его в окружающую среду, нуклеотиды не могут эффективно проникать через клеточные мембраны.

Все протоколы трансфекции разработаны таким образом, чтобы генетический материал мог преодолеть этот барьер. Нуклеотиды, блокирующие выработку белка, такие как малые интерферирующие РНК, могут начать выполнять свою функцию сразу после попадания в цитоплазму. Однако конструкции на основе ДНК должны быть транспортированы в ядро для транскрипции, прежде чем начнется синтез белка.

В делящихся клетках разрушение ядерной оболочки во время митоза может привести к включению трансфецированной ДНК в восстанавливающиеся ядра дочерних клеток. Поскольку большинство культивируемых нейронов являются постмитотическими — то есть неделящимися — клетками, для успешной индукции экспрессии генов требуются специализированные протоколы трансфекции.

Начнем обзор данных протоколов с нуклеофекции. Этот метод основан на сочетании индуцированного электрического поля и химических реагентов, которые совместно создают временные пороподобные структуры как в клеточных, так и в ядерных мембранах. Поскольку нуклеотиды заряжены, электрическое поле также способствует перемещению ДНК через эти поры.

Для выполнения этой процедуры нейроны в суспензии осаждают путем центрифугирования с последующим ресуспендированием в коммерческом реагенте для нуклеофекции. Затем смесь клеток объединяют с очищенной ДНК и переносят в кювету для электропорации, которая оснащена двумя алюминиевыми пластинами, обеспечивающими электрический контакт с аппаратом Nucleofector. Устройство подает серию коротких электрических импульсов, количество и длительность которых подбираются в зависимости от типа клеток. После нуклеофекции клетки можно разбавить культурной средой и высеять для дальнейшего роста.

В качестве альтернативы можно использовать метод генной пушки, который позволяет преодолеть барьеры трансфекции путем выстреливания микрочастиц, несущих генетический материал, сквозь клеточные и ядерные мембраны.

Для создания микрочастиц для генной пушки ДНК, кодирующая интересующий вас ген, осаждают на микросферах, которые обычно состоят из золота. После 10-минутной инкубации микросферы промывают и переносят в трубку. Затем трубку вращают по мере высыхания раствора, что обеспечивает равномерное покрытие микросфер. После этого трубку разрезают на картриджи и загружают в пушку. Доставка генетического материала с помощью газового привода может быть осуществлена в клетки, растущие в стандартных культуральных планшетах, простым нажатием на спусковой крючок.

Наконец, вирусная трансдукция использует жизненный цикл вируса для доставки чужеродного генетического материала в ядро. РНК, кодирующая интересующий ген, упаковывается в модифицированные ретровирусы, известные как лентивирусные векторы, которые проникают в клетки-мишени путем связывания со специфическими мембранными белками, что вызывает слияние мембран. Затем вирусная РНК подвергается обратной транскрипции с образованием комплементарной цепи ДНК, которая транспортируется в ядро.

Перед началом этой процедуры обратите внимание, что вирусы могут инфицировать как клетки вашего организма, так и клетки в чашке, поэтому строгое соблюдение правил техники безопасности крайне важно.

Первым этапом является получение лентивирусных частиц, несущих интересующий вас ген. Это достигается путем экспрессии структурных компонентов вируса в клеточной линии человека, оптимизированной для производства вируса, например, в клетках 293T. Чтобы избежать нежелательного распространения сконструированных вирусов, гены, необходимые для их сборки, отделены от трансферного вектора, последовательность которого будет включена в инфекционную частицу.

Полностью собранные вирусы высвобождаются в культуральную среду примерно через 2 дня, откуда их можно собрать и сконцентрировать с помощью ультрацентрифугирования. Затем определяется подходящая концентрация, или титр, вируса путем оценки эффективности трансдукции на тестовой клеточной линии. После этого лентивирусный вектор добавляют в культуру целевых нейронов и обычно инкубируют от 24 до 48 часов, чтобы обеспечить прохождение инфекции.

Теперь, когда вы ознакомились с распространенными методами трансфекции, выбор конкретного способа будет зависеть от целей ваших экспериментов. Рассмотрим несколько примеров.

Для начала, наблюдение за созреванием нейронов в культуре позволяет детально анализировать морфологические изменения, важные для формирования нейронных связей, например, образование дендритных шипиков. Чтобы визуализировать морфологию клеток с течением времени, исследователи использовали нуклеофекцию для доставки флуоресцентного белка в культивируемые нейроны. В данном случае в часть клеток была трансфицирована тубулин-белок с флуоресцентной меткой, что позволило детально изучить клеточные отростки с помощью флуоресцентной микроскопии. Поскольку уровни экспрессии сохранялись на протяжении всей жизни нейрона, морфологический анализ можно было проводить в течение как минимум одного месяца культивирования.

Трансфекция также может применяться для изучения влияния специфических генетических мутаций на функцию нейронов. С помощью генной пушки можно доставить ДНК, кодирующую белок дикого типа или его мутантные формы, после чего можно оценить краткосрочное воздействие на клеточную биологию, например, с помощью метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) для записи активности нейронов.

Наконец, распространенной стратегией проверки функции гена является наблюдение за тем, что происходит с клетками при блокировании его экспрессии. Для таких экспериментов могут использоваться лентивирусные векторы для доставки конструктов сайленсинг-РНК, которые предотвращают синтез белка. В данном эксперименте нокдаун генов, связанных с болезнью Паркинсона, приводит к значительному снижению жизнеспособности клеток.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по трансфекции нейронов. В этом ролике мы представили принципы трансфекции нейронов, а также процедуры и области применения трех распространенных стратегий трансфекции.

Спасибо за просмотр!