Производство и таргетинг одновалентных квантовых точек

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обеспечить простой и обобщаемый протокол для получения моновалентных квантовых точек для визуализации одной молекулы мембранных белков-мишеней в живых клетках. Это достигается путем введения сначала стехиометрического количества длинного полифосфоолигонуклеотидного лиганда в квантовую точку. Длинная ДНК полностью оборачивает квантовую точку и препятствует связыванию второй молекулы ДНК, тем самым генерируя моновалентные квантовые точки исключительно и количественно. Отдельно.

Бензогиновая функционализированная ДНК, несущая комплементарные последовательности, подготавливается к нацеливанию на мембранные белки, экспрессируемые на живых клетках. Далее, последовательная обработка живых клеток, экспрессирующих snap меченые мембранные белки бензогвинией, ДНК, с последующим нанесением моновалентных квантовых точек, приводит к селективному мечению целевого рецептора. Заключительным этапом является визуализация целевого распределения белка и траекторий диффузии с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием одной молекулы.

В конечном счете, динамическая пространственно-временная информация о белках-мишенях в живых клетках извлекается в режиме реального времени, чтобы показать, как молекулы-мишени работают in vivo. Основным преимуществом такого подхода к синтезу моновалентных квантовых точек является его простота и общедоступность. В отличие от многих других подходов, требующих специальных навыков или оборудования, этот подход относительно прост.

Как следствие, он должен быть доступен любой лаборатории и для любой дисциплины. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы с Зевой начали обсуждать, как можно объединить наши знания в области синтеза наночастиц ДНК для лучшего контроля реакционной способности наночастиц. Мы вместе провели эксперименты по первоначальному принципу утверждения в течение выходных.

Все чаще наше первое испытание срабатывало успешно. В этом видео мы используем моновалентные квантовые точки для изучения динамики одиночных частиц рецептора notch в живых клетках млекопитающих. Тем не менее, эти моновалентные квантовые точки должны найти широкое применение для любых исследований, требующих отслеживания отдельных частиц.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что не все коммерчески доступные квантовые точки одинаковы ни геометрически, ни химически. Поэтому потребуется некоторая оптимизация. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение при фазовом переносе, а этапы добавления ДНК, связанной с фосфором I, могут быть пугающими для лаборатории, не имеющей опыта в области мультисинтетической химии.

Для начала разведите 200 микролитров одномикролярного раствора квантовых точек органической фазы с 400 микролитрами хлороформа в стеклянном флаконе объемом пять миллилитров. Соедините эти квантовые точки со смесью из 400 микролитров 0,3 молярного раствора тетрабутиламмония бромида хлороформа и 36 микролитров чистого пек тиола и взболтайте на ночь. Затем добавьте 800 микролитров 0,2 моляра гидроксида натрия водного раствора и взбалтывайте в течение 30 секунд.

Фазовый переход происходит в течение нескольких минут, о чем свидетельствует переход окрашенных частиц в водную фазу над более плотной органической фазой. Если частицы агрегируются в третьей фазе между водной и органической фазами, увеличьте время инкубации с помощью регулятора PEC. Если водная фаза остается прозрачной, квантовые точки не передают фазу.

Увеличьте концентрацию регулятора грудной мышцы, чтобы уменьшить плохой фазовый перенос. Далее восстановите цветную водную фазу. Затем сконцентрируйте собранные квантовые точки со спиновой колонкой ракона до одного миллилитра.

Добавьте концентрированный раствор квантовых точек в колонку cidex NEP 10, уравновешенную 10 миллимолярным трис-буфером, содержащим 30 миллимоляров хлорида натрия. pH 8 вымывайте квантовые точки с 1,5 миллилитровыми элюирующими буферами под действием силы тяжести. Приступайте к измерению концентрации квантовых точек с помощью абсорбционной спектроскопии на 350 нанометрах.

Чтобы получить моновалентные целевые квантовые точки, купите или синтезируйте фосфо восемь ДНК, приготовьте один миллилитр 100 аномолярного раствора квантовых точек в 10 миллимолярном трис-буфере, содержащем 30 миллимоляров натрия хлорида pH 8. Затем добавьте 500 микролитров 100 наномолярного раствора фосфо IO ДНК. По капле к водным квантовым точкам в течение одной минуты, энергично помешивая.

Перемешайте или поставьте смесь на шейкер еще на девять часов. Удалите примерно 10 микролитров смеси квантовых точек для нанесения аналитического агроса. Также удаляют аналогичную концентрацию несопряженных квантовых точек в водной фазе.

Затем примерно на два микролитра шесть x fi вызовите загрузочный буфер для увеличения плотности раствора. Запустите эти два образца вместе на геле AROS объемом 0,8% веса в буфере из бида натрия в течение 15 минут при напряжении 150 вольт. В результате должна получиться одна полоса на несопряженной управляющей полосе, мигрирующая близко к скважине, и две полосы на полосе с сопряженными квантовыми точками.

Вычислите долю несопряженных квантовых точек, используя относительную интенсивность двух каналов. Затем используйте эту дробь для вычисления дополнительного объема 100 наномолярного раствора фосфофо-восьми ДНК, необходимого для того, чтобы соответствовать количеству квантовых квантовых точек. Повторите процедуру еще раз с этим рассчитанным объемом или до тех пор, пока сопряженные квантовые точки не свернутся в одну полосу на геле, что указывает на полное сопряжение всех квантовых точек.

Далее добавьте 100 микролитров 10 миллимолярных карбокси. Прикрепите шесть алкантиолов к конъюгированным одновалентным целевым квантовым точкам и встряхните в течение 10 минут. Чтобы удалить избыток алкана пеголя, добавьте 0,5 миллилитра раствора квантовых точек в пятиколоночный стакан ACE fitex knap, предварительно уравновешенный элуцианским буфером.

Затем соберите моновалентные целевые квантовые точки с одним миллилитром буфера elu под действием гравитационного потока. Сконцентрируйте собранные квантовые точки с помощью центрической спиновой колонки. Эти моновалентные целевые квантовые точки могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия в месяц, употребляя моновалентные квантовые точки непосредственно перед экспериментом по визуализации с использованием реагентов, таких как казеин или клетки бычьей сывороточной альбуминной пластины, экспрессирующие белок snap tagg при полном внутреннем отражении, флуоресценции или стекле качества газона.

В этом конкретном эксперименте мы используем клеточную линию U2 OS, экспрессирующую рецептор с меткой snap и высококачественные стеклянные поверхности после того, как клетки прикрепились к стеклу, удаляют питательную среду и промывают фосфатно-соевым буфером или PBS. Затем инкубируйте клетки в течение 10-30 минут при комнатной температуре в PBS или клеточных средах, содержащих ДНК бензогуина, приготовленных в соответствии с текстовым протоколом, после инкубации с бензогуином, ДНК, тщательно промойте клетки PBS или клеточной средой, затем инкубируйте клетки в течение примерно 5-10 минут с моновалентными квантовыми точками. Промойте несвязанные моновалентные квантовые точки и верните клетки в буфер или среду, подходящую как для визуализации, так и для культурального изображения.

Клетки, использующие газонный микроскоп из-за яркости моновалентных квантовых точек, собирают изображения с высокой частотой кадров в газоне, визуализируя базальную сторону живой клетки. После того, как квантовые точки покрыты отрицательно заряженной ДНК, они должны мигрировать на геле отдельно от необработанных квантовых точек, используя аликвоту неразвернутых квантовых точек в качестве контроля. Вторая, более быстрая мигрирующая полоса должна появиться при добавлении Phosphol IO eight DN. Продемонстрировано полное формирование моновалентных квантовых точек с потерей неподвижной полосы и ее коллапсом в подвижную полосу.

Если аликвота произведения моновалентных квантовых точек мигрирует в виде одной полосы, отделяемой от развернутых квантовых точек, то квантовые точки действительно являются одновалентными и готовы к использованию на дальнейших этапах. Здесь показано репрезентативное мечение клеток, экспрессирующих конструкцию вишни M с защелкой при различных концентрациях моновалентных квантовых точек. Одновалентные квантовые точки, пассивированные с помощью PEG 12 co, локализованные с помощью вишни M, указывающие на специфическую маркировку.

Более низкая плотность маркировки, как правило, предпочтительна для отслеживания отдельных частиц. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как синтезировать флуоресцентную наночастицу, которая является яркой модульной моновалентной и целенаправленной После освоения этого метода можно сделать за два сбора данных моновалентных квантовых точек и одну часовую маркировку фотоячейки, если она выполнена правильно. Важно помнить, что с помощью коммерчески доступных исходных реагентов мы можем получить моновалентные квантовые точки с отличными фотофизическими свойствами, которые можно использовать для длительных экспериментов по отслеживанию одиночных частиц.

После этой процедуры другие белки могут быть помечены с помощью слияний снэп-тегов, чтобы отслеживать их молекулярную динамику на живых клетках. При работе с квантовыми точками может быть чрезвычайно трудно получить пыль, поэтому не забудьте надеть защитные защитные перчатки и лабораторные халаты во время выполнения этой процедуры.