Специфика анализа белковых лизина метилтрансферазы Использование SPOT пептидов массивов

Общей целью данного эксперимента является исследование субстратной специфичности протеин-лизинметилтрансфераз или ФК мтс. Это достигается за счет идентификации исходного субстрата и получения пептидных матриц с несколькими вариантами этого субстрата, содержащими одиночные аминокислотные обмены в разных положениях. В качестве второго этапа пептидную решетку инкубируют с ПКМТ в присутствии радиоактивного донора метильной группы, что позволяет обнаруживать метилирование пептидов путем переноса радиоактивности на соответствующее пептидное пятно.

Затем на матрицу наносят рентгеновскую пленку и количественно анализируют с целью определения активности метилирования на каждом из пептидов. А чтобы определить профиль специфичности ПКМТ, результаты показывают, какие аминокислоты в пептиде субстрата имеют решающее значение для его метилирования ПКМТ. Основное преимущество этого метода или существующих методов, таких как метилирование отдельных пептидов, заключается в том, что ряд различных пептидов может быть протестирован в одном эксперименте экономически эффективным способом.

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области метилирования белкового лима, такой как спецификация ранее неизвестных новых субстратов PK mtss. Таким образом, этот метод может дать представление о специфике PK mts. Он также может быть применен к другим системам, таким как протеинкиназы, другие белковые методы, трансферазы или добавление к трансферазам.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я познакомился с возможностью получения больших пользовательских пептидных массивов по разумным ценам с использованием пептидного точечного синтеза. Введите пептидные последовательности в виде однобуквенного кода, каждая буква которого определяет конкретную аминокислоту после этого предварительного набухания, аминокислотного пега функционализирует точечную мембрану в конце, конец диметилформамида или ДМФА в течение 10 минут. Когда закончите, поместите влажную мембрану на раму точечного синтезатора без пузырьков воздуха и складок.

Полностью высушите мембрану в течение не менее 10 минут перед началом программы синтеза. Промойте мембрану три раза 100% этанолом, чтобы создать амидную связь со свободной аминогруппой на мембране. Активируйте карбоксильную группу поступающей аминокислоты, добавив к производному аминокислоты DIC и этилгидроксиаминоиноацетат.

После активации определите желаемые объемы активированных аминокислот на функционализованной мембране аминокислот с помощью программируемого робота. Повторите предыдущий шаг три раза, чтобы обеспечить лучшее сцепление первой активированной аминокислоты. После инкубации мембраны в течение 20 минут промойте ее DMF, чтобы удалить разъединенные аминокислоты после высыхания и блокировки свободных аминогрупп.

Промойте мембрану DMF четыре раза, а затем инкубируйте с 20% пиперином в DMF в течение 20 минут, чтобы удалить защитную группу FM. После промывки и высыхания мембраны повторяйте этапы удаления пятен и удаления F MOC до тех пор, пока не будет достигнута желаемая длина пептида. После последней защиты F MOC группы D промойте мембрану DMF и 100% этанолом.

Затем обработайте мембрану 0,02%-ным феноловым синим в ДМФА в течение как минимум пяти минут, пока она полностью не посинеет. После промывки и высыхания мембраны снимите ее с синтезатора и поместите в химически стойкую коробку. Обработайте его 20-25 миллилитрами защитной смеси для боковой цепи D, состоящей на 95% из трихлоруксусной кислоты для расщепления защитных групп боковой цепи и реагентов-поглотителей для защиты боковых цепей аминокислот от модификации.

Убедившись, что глубокая защитная смесь покрывает мембрану, полностью закройте коробку и инкубируйте ее в течение одного-двух часов, осторожно встряхивая после инкубации. Промойте мембрану шесть раз 20-25 миллилитрами дихлорметана в течение двух минут каждый. После двукратной промывки 100% этанолом просушите мембрану в влагопоглотителе в течение ночи.

Затем предварительно инкубируйте мембрану пептидной матрицы в герметичном пластиковом пакете, содержащем соответствующий буфер метилирования без фермента и обладающий радиоактивно меченой метильной группой. В течение 10 минут выбросьте буфер для предварительной инкубации и инкубируйте мембрану в восьми миллилитрах буфера метилирования, содержащего соответствующую ПКМТ, в течение одного-двух часов. После этого выбросьте буфер метилирования в контейнер для радиоактивных отходов и промойте пептидные массивы пять раз 20 миллилитрами буфера, содержащего 100 миллимолярных бикарбонатов аммония, и 1%STS в течение пяти минут, чтобы удалить связанный белок. После того, как вы выбросите последний промывочный буфер в контейнер для радиоактивных отходов, инкубируйте мембрану в течение пяти минут в 10 миллилитрах раствора амплификатора.

Затем сбросить раствор амплификатора в контейнер с радиоактивными отходами для органических растворителей. Запечатайте пептидный массив в полиэтиленовый пакет и поместите его в авторентгенографическую кассету. Поместите авторентгенографическую пленку на пептид в темном помещении.

Затем осторожно закройте кассету. После экспонирования пленки при температуре минус 80 градусов Цельсия проявите ее для анализа полученных результатов. Наконец, сделайте снимок пару раз с разным временем экспозиции, чтобы избежать насыщения сильно метилированными пептидными субстратами.

Приведен пример реакции метилирования пептидной матрицы с NSD. Горизонтальная ось представляет собой последовательность пептида и в вертикальном направлении. Измененная аминокислота обозначена метилированием с помощью nsd, один из них показывает, что она специфически действует на H 3 K 36 и распознает от трех до четырех аминокислотных остатков по обе стороны от мишени.

Около 85% пептидов демонстрируют стандартные отклонения меньше плюс-минус 20%, а более 97% пептидов демонстрируют стандартные отклонения меньше плюс-минус 30%Рассчитанные данные коэффициента дискриминации показывают, что NSD one предпочитает ароматические остатки в положении минус два. На участках минус один и плюс два предпочитает гидрофобные атические остатки. А на участке плюс один есть предпочтение аргинину, лизину, глутамину или аспарагину.

Потенциальные новые пептидные субстраты могут быть найдены путем поиска в базе данных протеома человека. Сильное метилирование некоторых из этих пептидов с помощью ome подтверждает их идентичность в качестве новых субстратов NSD-одного пептида. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что после этой процедуры необходимо использовать наиболее подходящий исходный субстрат.

Другие методы, такие как метилирование соответствующих белков in vitro и в клетках, могут быть выполнены для того, чтобы выяснить, принимаются ли белки в качестве субстратов, а также после их развития. Этот метод проложил путь исследователям в области мезилирования белка лизина, чтобы определить субстратную специфичность многих PK mts и идентифицировать несколько новых субстратов. Это помогло понять важную биологическую функцию ФК мтс.

Не забывайте, что работа с радиоактивностью и органическими растворителями в синтезе пептидов может быть доказана, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать соответствующие меры предосторожности.