Интернационализация и наблюдение флуоресцентных биомолекул в живых микроорганизмов с помощью электропорации

Целью этой процедуры является интернализация и визуализация биомолекул, таких как ДНК или белки, меченные органическим фтором, внутри живых микроорганизмов с помощью метода, основанного на электропорации. Это достигается путем первичной инкубации электрокомпетентных клеток с флуоресцентно мечеными биомолекулами перед их переносом в электропорационную вету. При подаче высокого напряжения на вету, временные образования пор как на клеточной стенке, так и на клеточной мембране обеспечивают биомолекулярную диффузию в клетки.

Затем клетки инкубируют в богатой среде, чтобы они могли восстановиться до того, как будут удалены избыток неинтернализованных биомолекул. Наконец, клетки переносят на подушечку с низкой флуоресценцией с минимальным содержанием питательных веществ, а затем сверху накладывают стеклянную крышку, чтобы сформировать стеклянный агробутерброд. В конечном счете, сущностная микроскопия используется для анализа расположения, характера диффузии и динамических свойств меченых биомолекул внутри живых клеток.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы осознали ограничения в визуализации живых клеток. Из-за быстрого сбоя фотофлуоресцентных белков, таких как GFP, мы пришли к выводу, что, загрузив живые клетки биомолекулами, помеченными органическим флуором, мы сможем осуществить трансплантацию живых микроорганизмов. Основными преимуществами этой силы являются яркость, фотостабильность, а также небольшие размеры.

Затем мы надеемся проследить локализацию и диффузию ДНК или белков в их естественной среде в гораздо более длительных временных масштабах, которые будут соответствовать многим важным биологическим процессам. Основное преимущество этих методов перед существующими методами, такими как микроинъекции, заключается в том, что их также можно применять к микроорганизмам, диаметр которых меньше диаметра типичной иглы для микроинъекций. Дополнительным преимуществом электропорации является то, что большое количество клеток может быть одновременно загружено флуоресцентными биомолекулами и параллельно визуализировать их, что делает электропорацию особенно высокопроизводительным методом.

Хотя этот способ может дать представление о диффузии и динамике флуоресцентно меченных биомолекул in vivo, он также может быть применен в других контекстах, таких как электродные биомолекулы, которые не мечены, но он может, например, вызвать физиологическую реакцию при интернализации клеткой. Затем быстро растопите раствор 2%AROS в дистиллированной воде с помощью лабораторной микроволновой печи. Добавьте один соответствующий объем горячей розы ГК в фильтрующий материал и аккуратно дозируйте смесь вверх и вниз. Во избежание образования пузырьков немедленно пипетируйте примерно 200 микролитров возникшей смеси на крышку микроскопа стандартного размера.

Оставьте чехол на скамейке на минуту при комнатной температуре, пока гель не застынет или временно не накопит место второго очищенного чехла, нанесите его на свежую подушечку и аккуратно надавите сверху на взрыхление яичной розы, начиная с запаса флуоресцентных биомолекул, приготовленных в буфере с низкой ионной силой. Перенесите до пяти микролитров биомолекул либо в 20 микролитров компетентных бактерий, либо в 50 микролитров компетентных дрожжевых клеток. Количество флуоресцентных биомолекул, инкубируемых с клетками, напрямую коррелирует с количеством биомолекул, интернализованных на клетку.

После электропорации выдержать смесь на льду до 10 минут. В то же время выберите электропорационный стенд с подходящим расстоянием между электродами и охладите на льду. Переложите клеточную смесь в предварительно охлажденную ветку.

Слегка постучите по вете несколько раз, чтобы удалить пузырьки из раствора. Удалите влагу с веты бумажным полотенцем и поместите вету в электроатор. Подайте импульс высокого напряжения на элементы сразу после этого процесса.

Убедитесь, что постоянная времени, отображаемая на электроаторе, находится в диапазоне от четырех до шести миллисекунд. Более низкие временные константы часто связаны с присутствием избытка соли или пузырьков внутри qve, и это может уменьшить или полностью ингибировать поглощение биомолекул клетками. Импульсы более высокого напряжения улучшают нагрузку на ячейку, но также могут повлиять на жизнеспособность ячейки сразу после электропорации.

Добавьте 500 микролитров насыщенной среды и перенесите клетки в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Дайте клеточной мембране восстановиться, инкубируя бактерии при температуре 37 градусов Цельсия или дрожжи при температуре 29 градусов Цельсия в течение от двух до 10 минут. После включения биомолекул и восстановления роста раскрутите клетки в течение одной минуты в предварительно охлажденной центрифуге при температуре 4 градуса Цельсия и выбросьте агент Риза.

Суспензируйте гранулу в 500 микролитрах буфера и повторите процессы отжима и удаления и буферной суспензии. Еще три раза. Эти этапы промывки удалят все следы неинтернализованных биомолекул из клеточной суспензии.

В случае интернализации меченого белка и дополнительной очистки этап проводят путем пипетирования клеточной суспензии в пробирку объемом 1,5 мкл, снабженную сверху мембранным фильтром толщиной 0,22 мкм. Отделите ячейки от буфера с помощью центрифугирования, убедившись, что над фильтром остается достаточно жидкости, чтобы избежать высыхания ячеек и отбросить проточную фракцию. Ниже фильтра добавьте 500 микролитров свежего PBS на ячейки и повторите комбинацию вращения вниз с последующим выпуском свежего PBS.

Еще два раза. Выполните финальный спин вниз при 3 300 G в течение одной минуты. Чтобы удалить предыдущую промывку PBS, повторно суспензируйте ячейки 150 микролитрами PBS.

Наконец, снимите верхнюю крышку с ранее изготовленной прокладки aros. Загрузите клетки на прокладку, пипетируя по каплям 10 микролитров клеточной суспензии. После установки нового очищенного покровного стекла поверх возникшей прокладки сэндвич-ячейки теперь готовы к флуоресцентной микроскопии.

Отрицательные контрольные препараты, такие как нерейтинговый контроль, который был инкубирован с мечеными биомолекулами или пустыми клетками, которые не были подвергнуты электрооценке или инкубации, также должны быть приготовлены параллельно с любыми загруженными образцами, загруженные клетки могут быть визуализированы на любом подходящем флуоресцентном микроскопе. В то время как режим широкоугольной визуализации позволяет визуализировать и анализировать на клеточном уровне, газонный или высокий низкий уровень освещенности или оптимальный для наблюдения и отслеживания отдельных молекул. Чтобы предотвратить чрезмерное фотообесцвечивание биомолекул, перед загрузкой образца убедитесь, что все лазерные лампы на сцене выключены или заблокированы непрозрачным фильтром.

Кроме того, отключите усиление камеры E-M-C-C-G, чтобы предотвратить повреждение камеры при передержке. Для установки инвертированного микроскопа поместите сэндвич с прокладкой Aris на предметный столик микроскопа закрытой стороной ячейки вниз к нижнему объективу. Затем включите верхнюю сторону галогенного света и сфокусируйте клетки в режиме микроскопии проходящего белого света, перед включением лазера сфотографируйте клетки в режиме пропускания белого света.

Эта фотография будет использоваться в качестве опорной карты положения, которая будет коррелировать области биомолекулярной флуоресценции с фактическим расположением клеток в пределах одного и того же поля зрения. Для измерения жизнеспособности используйте нагреватель объектива, установленный на оптимальную температуру, и записывайте последовательные изображения одного и того же поля зрения при освещении белым светом каждые 30 минут, не перемещая предметный столик, выключите верхнюю подсветку и защитите образец от всех других источников окружающего света в лаборатории. Затем включите ПЗС-камеру и начните сбор данных.

Начните запись флуоресцентного иона непосредственно перед включением лазерной подсветки. После выполнения флуоресцентной микроскопии начните анализ данных, открыв все фотографии с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как Image J, чтобы начать нормализацию всех основных параметров изображения, таких как яркость или контрастность, на всех изображениях, нажав кнопку «Установить», и выберите распространение на все остальные изображения. В первом варианте можно качественно установить, была ли загрузка ячейки успешной, так как нагруженные ячейки должны быть значительно ярче, чем неэлектропорированные ячейки, используемые в качестве отрицательного контроля для данного изображения.

Используйте инструмент свободного выделения рукой и обведите различные области флуоресценции нарисованными от руки многоугольниками. Сравните интенсивность флуоресценции среди всех соответствующих полигонов, выбрав опцию измерения в меню анализа. Повторите этот процесс вручную или с помощью автоматического скрипта, чтобы извлечь интенсивность на пиксель всех ячеек в каждом образце и отрицательном контроле.

Когда электроэлементная ячейка загружена одной или несколькими флуоресцентными биомолекулами, ее средняя интенсивность излучения будет больше, чем средняя интенсивность отрицательного контрольного образца. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, вручную подсчитайте процент деления неповрежденных неделящихся и поврежденных клеток. В одном и том же поле зрения, данные которого регистрировались каждые 30 минут на нескольких участках, не всегда возможно подсчитать количество биомолекул, интернализованных одной клеткой напрямую, особенно когда биомолекулы быстро диффундируют или когда клетки загружены более чем пятью мечеными биомолекулами.

Анализ фотообесцвечивания клеток позволяет оценить количество меченых биомолекул на клетку в таких условиях. С помощью кнопки выбора от руки обведите контур данной флуоресцентной клетки и экстракта и нарисуйте график флуоресценции исходных клеток в зависимости от времени из-за эффектов фотообесцвечивания. График зависимости интенсивности от времени будет представлять собой экспоненциально уменьшающуюся кривую для сильно нагруженных клеток, но для клеток, содержащих менее 10 биомолекул, должны быть различимы четкие шаги.

Рассчитайте среднюю автофлуоресценцию после фотообесцвечивания путем усреднения исходных значений интенсивности флуоресценции вблизи плоской хвостовой части эксперимента, которая может быть, например, от последних 50 до 100 кадров изображения в серии интервальной съемки. После определения базовой линии и интенсивности рассчитайте зависящую от времени интенсивность фотообесцвечивания, вычитая базовую автофлуоресценцию из необработанных данных флуоресценции, затем заблокируйте полученные данные об интенсивности фотообесцвечивания и квантовайте высоту каждого шага вручную или с помощью алгоритма. Этот процесс следует повторить для нескольких ячеек, демонстрирующих в общей сложности более 100 ступеней, чтобы получить точную оценку средней высоты ступени, эта величина соответствует интенсивности унитарной флюорочетверки из-за обесцвечивания одной флюорочетверки.

Наконец, количество интернализованных молекул на клетку можно рассчитать, разделив исходную вычитаемую интенсивность клеток в момент времени, равную нулю, на унитарный фтор. Четыре интенсивности для этого протокола электропорации. Количество флуоресцентно меченой ДНК или белка, которые могут быть интернализованы в бактерии или дрожжи, можно контролировать, регулируя количество зондов ДНК, присутствующих в буфере электропорации.

Когда скорость интернализации биомолекул высока, время жизни меченой биомолекулы при фотообесцвечивании, которое можно найти, сначала построив график интенсивности флуоресценции как функцию времени, а затем выделив ее экспоненциальную постоянную времени, дает информацию о фотостабильности красителей in vivo. В случае низких скоростей включения, квантование интенсивности флуоресценции обеспечит средство для аппроксимации общего числа биомолекул в данной клетке. Электропорация также может быть использована для включения белков в бактерии или дрожжи.

В случае флуоресцентно меченого белка. Поскольку свободные флуорофоры сами по себе могут быть интернализованы очень эффективно, важно удалить все избыток свободных и нековалентно присоединенных флуорофоров из белкового запаса. Наконец, дважды меченные нашими молекулами также могут быть интернализованы с помощью нашего метода, позволяющего наблюдать за одиночными молекулами в живых клетках в течение нескольких секунд.

При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать также о подготовке и анализе контрольных образцов, таких как неэлектроэлементы, которые инкубируются с меченой биомолекулой, или пустые клетки, которые не подвергаются электропорации и не инкубируются с меченой молекулой. Эти меры контроля позволяют нам оценить уровень автофлуоресценции клеток и дефицит этапов промывки, и как таковые необходимы для оценки того, был ли эксперимент по электропорации успешным после его разработки. Этот метод открыл новые возможности для исследователей в области биофизики и третьей биологии для изучения диффузии и динамического поведения биомолекулы-метки в живых микроорганизмах.

И это на один-два порядка дольше, чем с автофлуоресцентными белками, такими как GFP. Он перенес гибкость органического d-мечения in vivo, что сделало эксперименты с угрозой одной молекулы гораздо более осуществимыми для изучения внутри- и межмолекулярной динамики в живых клетках.