Выявление и анализ повреждений ДНК в клетках мышиной скелетных мышц На месте Использование Тюнеля метод

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении разрывов ДНК и гибели клеток в С-2. Это достигается за счет первых срезов проникающей ткани, позволяющих туннельным реагентам проникать в ядро клетки. Затем фермент TDT используется для ковалентного присоединения DTP к трем основным концам разрывов ДНК в этих клетках.

Затем DUTP помечается флуоресцентным зондом. В конечном счете, положительный сигнал туннеля количественно определяется в срезах тканей, отражающих относительную частоту разрывов ДНК в клетках. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как саузерн-блоттинг или иммуногистохимия, заключается в том, что он относительно специфичен и обеспечивает способ устранения шума и автофлуоресценции.

Начните с фиксации изолированных задних конечностей в 4%-ном параформальдегиде в PBS в 15-миллилитровой трубке, позволяющей фиксации продолжаться в течение четырех или максимум 24 часов при четырех градусах Цельсия. Всего два часа нужно, если ткань эмбриональная. Однако после фиксации замените раствор на 10% сахарозы, чтобы защитить ткань от криозащиты, и инкубируйте ее в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

На следующий день смените раствор на стерильный процеженный 30%-ной сахарозой и продолжайте инкубацию в течение ночи или до тех пор, пока задние конечности не опустятся на дно трубки. При встраивании важно, чтобы задние конечности были полностью погружены в среду для встраивания. Закладные формы могут быть размещены непосредственно на сухом льду или в изоп пентане на сухом льду для замораживания среды.

При криосекции. Блоки разрезают передаточные секции толщиной 10 микрон или тоньше, более толстые секции не будут проникать реагентами для маркировки туннелей. Соберите эти тонкие срезы на предметные стекла с желатиновым или векторным покрытием при комнатной температуре.

Очень быстро переложите горки в сухой лед для хранения. Сначала разморозьте предметное стекло замороженной ткани до комнатной температуры и дайте ему высохнуть в течение 16-64 часов. Как только предметное стекло достигнет комнатной температуры, увлажните его в соединительной банке, наполненной PBS, на 10 минут.

Повторите этот этап регидратации один раз, затем тщательно высушите предметное стекло лабораторной салфеткой, не повреждая участок ткани, чтобы он пропитался, поместите предметное стекло в камеру влажности и нанесите на него 50 микролитров коммерческих реагентов, не содержащих протеолитическое основание сапонина. Не наносите пипетку непосредственно на секции, так как она может отсоединиться или быть повреждена. Затем поместите небольшой кусочек пара-пленки на срез, чтобы распределить реагент.

Если образуются пузыри, повторно нанесите пара-пленку. Дайте предметному стеклу поинкубироваться в течение часа через час. Удалите реагенты с помощью двух пятиминутных промываний в PBS и осторожно промокните его насухо.

Помимо маркировки разрывов ДНК с помощью TDT, используйте имеющийся в продаже набор. Сначала сделайте один буфер XTDT и проведите пипеткой по секции. Затем выдержите предметное стекло в течение пяти минут в камере увлажнения.

Во-вторых, сделайте маркировочную смесь TDT в соответствии с инструкцией к набору или положительным контрольным слайдом. Добавьте ДНК в смесь для мечения TDT. Для отрицательного контрольного предметного стекла исключите фермент TDT из смеси.

Теперь с помощью салфетки удалите как можно больше буфера со предметного стекла и нанесите его пипеткой на маркировочную смесь. Достаточно 50 микролитров. Снова распределите раствор с параформом, не образуя пузырей.

Дайте предметному стеклу поинкубироваться в камере в течение часа теперь при температуре 37 градусов по Цельсию. В-третьих, сделайте буфер с одним x стопом в соответствии с инструкциями набора. После удаления маркировочной смеси с помощью лабораторной салфетки добавьте от двух до 300 микролитров стоп-смеси, чтобы полностью покрыть участок.

Затем инкубируйте предметное стекло в течение пяти минут в камере. На этом этапе не используется парапленка. Чтобы снять стопорный буфер, используйте две двухминутные промывки в PBS.

Теперь пижет 50 микролитров свежеприготовленного флуоресцеина раствора для мечения. На предметное стекло нанести перфил и выдержать 20 минут в камере, но теперь уже в темноте. Удалите этикетировочный раствор одной двухминутной промывкой в PBS, пока промывка разбавляет несколько крючков.

3 3, 2, 5 8 до одного микрограмма на миллилитр в PBS. После промывки покройте срезы в объеме от одного до 200 микролитров разбавленного раствора крючков. Затем выдержите предметное стекло в течение пяти минут, защитив его от света, чтобы удалить крючки до пятен, используйте три пятиминутные стирки в PBS.

Затем тщательно высушите предметное стекло лабораторной салфеткой и наклейте покровный лист для визуализации. Визуализируйте секцию с помощью фильтров dpi, fitzy и Texas red, чтобы разделить сигналы пятна крючков, туннельного пятна и автофлуоресценции на три канала ложных цветов в одном изображении. Стандартизируйте и поддерживайте одинаковые настройки изображения для всех слайдов, чтобы их можно было легко сравнивать.

Не используйте автоматические настройки экспозиции или усиления для анатомического ориентира. Используйте яркое светлопольное изображение соседнего участка задней конечности, окрашенного буквами h и e в программном обеспечении для анализа изображений. Выключите туннельный канал

Затем вручную обведите контур мышечной области, подлежащей количественному измерению, с помощью других каналов. Преобразуйте обведенную область в маску. Затем снова включите туннельный канал и отрегулируйте минимальный порог интенсивности, чтобы исключить автофлуоресцентный сигнал.

Используйте один и тот же пороговый предел для всех участков, анализируемых в исследовании. Далее преобразуем пороговые пиксели в маску. На каждом изображении объедините маску для мышечной области и маску порогового туннеля.

Это дает представление туннельного сигнала в пределах отслеживаемой мышечной области. Теперь количественно оцените комбинированную маску, чтобы определить количество туннельных положительных объектов и общую площадь в пикселях туннельного сигнала в мышце. Используйте эти значения для статистического анализа.

Туннельные положительные объекты с малым увеличением могут проявляться в виде ярких неправильных фрагментов в скелетных мышцах. Однако при более высоком увеличении следует наблюдать некоторые туннельные положительные объекты с классической морфологией апоптоза, если тип клеточной смерти включает этот апоптоз. Положительный контроль с добавлением D-ДНК должен демонстрировать обильный туннельный положительный сигнал, равномерно распределенный по всем тканям.

В разделе. Отрицательный контроль без фермента ТДТ должен иметь фон низкой интенсивности и проявлять только автофлуоресценцию. С помощью описанного протокола было установлено, что эритроциты костных и эндотелиальных клеток вносят свой вклад в аутофлуоресцентный сигнал в подготовленных участках высоких конечностей.

Истинный туннельный положительный сигнал был гораздо более интенсивным. Он может быть изолирован от автофлуоресцентного сигнала с помощью порога интенсивности пикселей. Другим вариантом выделения сигнала туннеля было цифровое вычитание красного автофлуоресцентного канала из туннельного канала.

С помощью этой методики происходит гибель скелетных мышечных клеток. В мышиной модели СМА туннельная маркировка выявила больше апоптотических клеток у пятидневных мышей с СМА, чем в контрольной группе. При количественной оценке туннельного окрашивания было показано, что это наблюдение является статистически значимым для нескольких групп мышц в задней конечности.

После освоения метод туннелирования может быть выполнен примерно за четыре часа для получения надежных количественных результатов.