Эффективное Вывод пигментного эпителия сетчатки клеток из стволовых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в воспроизводимом получении высококачественного пигментного эпителия сетчатки или РПЭ из стволовых клеток. Это достигается путем предварительного выращивания индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток до одинаковой беглости. На втором этапе среда изменяется, чтобы направить клетки в судьбу РПЭ.

Затем клетки РПЭ выделяют из других дифференцированных клеток в чашке, а затем размножают культуры до тех пор, пока не будет получено достаточное количество клеток. В конечном счете, темная пигментация и морфология булыжников культур могут быть использованы для подтверждения того, что клетки RPE достигают терминальной дифференцировки. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как спонтанная дифференцировка, заключается в том, что добавление определенных факторов ускоряет дифференцировку, время и увеличивает выход СИЗД.

Таким образом, на сегодняшний день тысячи грызунов были вылечены с помощью клеток RPE, полученных из различных дегенеративных заболеваний сетчатки IPSA. Однако, если мы эффективно и действенно переводим это в лечение людей в клиниках с этими заболеваниями, абсолютно необходимо, чтобы мы разработали хорошо зарекомендовавшие себя воспроизводимые протоколы, которые обеспечат нам высокое качество, большое количество продаж RPE и IPS Визуальная презентация этого метода имеет важное значение, поскольку только один человек может работать в микроскопе под капотом в любой момент времени. что затрудняет визуализацию этапа изоляции. Митчелл Принс, техник-исследователь из моей лаборатории, теперь продемонстрирует протокол, связанный с аспектами процедуры цифрового культивирования: руководить дифференцировкой культуры RPE, полученной из стволовых клеток, представляющей интерес линии стволовых клеток на слое эмбриональных фидерных клеток мыши в двух случаях по 10 до шести клеток на лунку шестилуночного планшета. Позвольте колониям достичь беглости КФ, а затем перейти на ежедневное кормление с дифференцировкой.

Среда дополнена никотинамидом. Через три недели начните добавлять в рацион активные препараты или IDE, чтобы улучшить дифференцировку РПЭ. Через две недели вернитесь к дифференцировочной среде и только никотинамиду, прекратив ежедневное кормление.

Как только показатели pH в среде перестанут желтеть на следующий день после кормления, верните культуру в инкубатор до тех пор, пока не появятся глазки пигментированных клеток, достаточно большие, чтобы их можно было вырезать и удалить. Для выделения пигментированных люверсов следующим слоем используются лунки 24-луночного планшета со свободной ксеноматрицей, которая имитирует естественную клеточную среду. Затем заполните столько лунок 24-луночной пластины дифференцирующим материалом, сколько необходимо.

А в капюшоне для клеточных культур используйте препарирующий эндоскоп и скальпель, чтобы разрезать каждую пигментированную глазку в нижней части исходной пластины на две-шесть частей и захватить пигментированные части острыми щипцами, а затем перенести по одному-два пигментированных кусочка в каждую.24. Хорошо инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех-пяти дней, пока клетки не прилипнут. Затем начните менять носители три раза в неделю.

Расширяйте клетки в течение трех-четырех недель в среде для дифференцировки. Продолжая подкармливать клетки три раза в неделю до прохода. В RPE добавляют 200 микролитров предварительно подогретого раствора для диссоциации клеток без трипсина при температуре 37 градусов Цельсия для отделения клеток.

Через пять-восемь минут остановите реакцию со свежими дифференцировочными средами, а затем повторно суспендируйте культуры в одноклеточные суспензии с помощью пипетки объемом 200 микролитров, объединив колонии с небольшим количеством клеток. Затем переведите диссоциированные колонии в 15-миллилитровые пробирки и раскрутите клетки вниз. Резус, суспендируя гранулы в трех миллилитрах дифференцировочной среды, переносит колонии в каждую лунку матрицы с кодом из шести лунок, содержащую три дополнительных миллилитра дифференцировочной среды на лунку.

Затем расширяйте клетки в течение одной-двух недель, пока клетки не станут примерно на 90% сливающимися, и снова отделите клетки в одном миллилитре диссоциативного раствора, как показано выше. На этот раз. Используя пипетку объемом 1000 микролитров для ресуспендирования клеток, переведите раствор одной клетки в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

А затем после раскрутки ячеек снова рес, суспензируют гранулу. Через 18 миллилитров дифференцировки среды окончательно репертируют клетки в матричном кодированном контейнере для культуры для получения максимального количества желаемых клеток в минимальном числе пассажей для дальнейшего последующего анализа, пигментированные колонии начинают появляться после пяти-семи недель культивирования индуцируемой плюрипотентной линии стволовых клеток. Эти колонии могут продолжать расти в течение нескольких недель, пока культуры поддерживаются.

Как только они достигнут достаточного размера, их можно вырезать вручную. Тщательная эксцизия во избежание контаминации клетками, не относящимися к РПЭ, значительно облегчает получение достаточно чистых культур РПЭ. После освоения большое количество клеток РПЭ может быть получено за 8-12 недель, если метод выполнен правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости быть осторожным, чтобы не загрязнить культуры во время производства среды и питания клеток. После просмотра этого видео мы надеемся, что многие из вас смогут производить большое количество высококачественных элементов RPE из IPS. Надеемся, что это будет способствовать более быстрому переходу от скамьи к постели больного и предложит клеточную терапию пациентам, страдающим от неизлечимых в настоящее время дегенеративных неоваскулярных заболеваний сетчатки.