Прижизненной визуализации аксонов Взаимодействие с микроглии и макрофагов у мышей Спинной колонки Давка травмы
23 ноября 2014 г.
Двухфотонная прижизненная визуализация может быть использована для исследования взаимодействий между различными типами клеток в спинном мозге в их естественной тканевой среде у химерного животного костного мозга с травматическим повреждением спинного мозга в дорсальном столбе.
Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за движением и взаимодействием между микроглией, моноцитами и другими типами клеток в поврежденном спинном мозге. Это достигается путем создания химерных мышей из костного мозга, которые будут иметь либо резидентную микроглию, либо макрофаги, полученные из костного мозга, помеченные флуоресцентным маркером. Вторым шагом является получение травмы дорсального столба в спинном мозге.
Затем животных снова вскрывают и стабилизируют спинной мозг Для многофотонной визуализации последним шагом является получение либо одиночных изображений, либо покадровых фильмов в пределах поражения. В конечном счете, анализ изображений показывает движение клеток и клеточное взаимодействие с окружающими субстратами. Основные преимущества этого метода по сравнению с традиционными методами, такими как клеточная культура и фиксированная ткань, заключаются в том, что клетки могут быть визуализированы в их естественной сложной среде в живом животном.
Для этой операции используют химерных или двойных трансгенных животных. Ознакомьтесь с текстовым протоколом о том, как помечать резидентные клетки или клетки, полученные из костного мозга после индуцирования анестезии, поддерживать его с содержанием фтора от 1 до 2% ISO для частоты дыхания от 60 до 100 вдохов в минуту. Теперь нанесите глазные мази и подтвердите хирургическую плоскость анестезии щипцом на пальце ноги.
Подготовьтесь к операции, сначала побрив целевую область спинного мозга, а затем протрите кожу повидон-йодом и 70%-ным спиртовым скрабом, накиньте животное и сделайте отверстие для доступа к месту операции. Затем разложите инструменты автоклава на стерильной простыне. Это включает в себя щипцы номер четыре, которые фиксируются на расстоянии одного миллиметра между зубьями и имеют отметки в одном миллиметре от кончиков.
Теперь можно открыть кожу по средней линии с помощью ножниц радужной оболочки, обнажив мускулатуру. Продолжайте операцию под микроскопом. По средней линии разрежьте мышцы спины в местах их прикрепления к дорсальным отросткам позвоночника с целью обнажения позвоночного столба.
Это включает в себя разрезание трапеции и связок широчайшей мышцы спины. Затем удалите мышцы-вращатели между поперечными отростками и дорсальным отростком, чтобы выявить пластинку конкретного позвонка, который необходимо удалить. Здесь обнажается Т 10.
Продолжайте, вставив наконечники присяжных RO в пространство над и под процессом. Затем слегка приподнимите, чтобы убедиться, что кончики надежно закреплены на месте и не слишком глубоки. Затем закройте присяжных заседателей RO, чтобы удалить пластинку.
Теперь удалите все мелкие части оставшегося позвонка, тем самым увеличив отверстие. С помощью иглы 30 калибра проткните два отверстия в твердой мозговой оболочке на расстоянии одного миллиметра, чтобы сделать точку доступа для неподвижных щипцов. Затем введите неподвижные щипцы под углом 90 градусов через твердую мозговую оболочку, сохраняя отметки на зубьях над твердой мозговой оболочкой.
Теперь зажмите щипцы на 10 секунд. Сделайте десятисекундное сжатие еще два раза и снимите щипцы. Далее смочите в физрастворе кусочек рассасывающегося желатина, спрессованную губку, и накройте им место травмы.
Закройте мышцу над желатиновой губкой с помощью синтетических ненейлоновых беговых швов номер четыре. Затем используйте пятимиллиметровые зажимы для раны, чтобы закрепить кожу. Завершите процедуру подкожным введением 10 микролитров бупивакаина в 490 микролитров физиологического раствора по одному миллиграму на килограмм.
Затем введите пять микролитров бупренорфина в ягодичную мышцу по 100 микрограмм на килограмм. Послеоперационный период. Согрейте животное и следите за ним, пока оно не придет в сознание. Чтобы снова открыть животное для визуализации, введите анестезию, как и раньше, а затем снимите зажимы для раны в соответствии с инструкциями производителя и инструкциями.
При необходимости нанесите средство для удаления волос на область вокруг разреза. На этот раз нанесите дополнительные скрабы с повидон-йодом и 70%-ным спиртом. Теперь снова откройте кожу вдоль предыдущего разреза.
Снимите оставшиеся швы и раскройте мышцы щипцами с помощью ножниц по мере необходимости. Под рассекающим микроскопом с помощью ножниц сделайте карманы для зажимов спинного мозга вдоль поперечных отростков на позвонке, на один уровень выше ламинэктомии и на один уровень ниже ламинэктомии. Вставьте зажимы стабилизатора спинного мозга вокруг каждого позвонка и затяните зажимы.
Отрегулируйте зажимы так, чтобы спинной мозг был параллелен платформе визуализации, а ткань была стабильной. Если вы видите артефакт дыхания, отрегулируйте зажимы, чтобы свести к минимуму движение. Затем накрывают хомутами и параформуют.
Далее аккуратно снимите гелевую пену с помощью щипцов. Удалите как можно больше. Кроме того, удалите всю толстую рубцовую ткань над мозговыми оболочками, которая может присутствовать.
Как только вся гелевая пена будет удалена, покройте спинной мозг физиологическим раствором. Если отмечается кровотечение, используйте желатиновую губку, чтобы остановить кровотечение. При необходимости используйте прижигание во время прижигания.
Будьте осторожны, не прикасайтесь к спинному мозгу и держите его покрытым физиологическим раствором и гелевой пеной. Теперь создайте лунку для погружения в жидкость, запечатайте кожу и ткани цианоакрилатным клеем. Затем соорудите лунку из стоматологического акрила между двумя зажимами.
Дайте колодцу время застыть. После отверждения заполните колодец искусственной спинномозговой жидкостью. Следите за кровотечением во время этих шагов.
На этом этапе по желанию вводят флуоресцентный сосуд в хвостовую вену. Чтобы выделить кровеносные сосуды во время визуализации, используйте флуоресцентную цепь DExT над квантовыми точками длиной 70 килодальтон или флуоресцентно меченные лектины. Во время визуализации поддерживайте мышь при температуре 37 градусов Цельсия в контролируемой среде На сцене микроскопа наиболее важными шагами для успешной подготовки являются обеспечение чистоты спинного мозга, отсутствия кровотечения и отсутствия видимых дыхательных артефактов.
Периодически во время визуализации проверяйте уровень анестезии, контролируя дыхание животного, которое должно составлять от 60 до 100 вдохов в минуту. Корректируйте анестезию, регулируя уровень фтора ISO. После визуализации верните животное в место операции, снимите спинальные зажимы и снимите акрил с кожи.
Затем мышь может быть закрыта для последующей визуализации в конце первоначальной операции или усыплена через пять дней после травмы. Места введения щипцов все еще видны, но поражение начало увеличиваться в размерах из-за вторичной травмы, вызванной воспалением. Аксоны на другом конце поражения оттянулись от первоначального места повреждения.
В то же время, можно наблюдать большой приток CX трех C-1-положительных клеток, микроглии или макрофагов, инфильтрирующих внутрь и вокруг поражения, чтобы различить поведение этих клеток в микроокружении поражения, сначала была использована модель радиационной химеры. Клетки-предшественники костного мозга мыши CX 3 CR one GFP были заменены на нефлуоресцентные донорские клетки, поэтому была видна только GFP-положительная резидентная микроглия ЦНС. Во-вторых, клетки-предшественники костного мозга у нефлуоресцентной мыши были заменены клетками костного мозга мыши CX с тремя CR и одним положительным GFP для просмотра клеток, полученных из костного мозга.
До травмы были обнаружены только GFP-положительные клетки, полученные из костного мозга, в основном параваскулярные, которые, как сообщалось, постоянно замещались из костного мозга после травмы. CX три C one положительные GFP-клетки увеличиваются вдоль внутренней части кровеносных сосудов, окружающих поражение. Кроме того, центр поражения был заполнен инфильтрирующими CX тремя CR one положительными GFP макрофагами.
Используя эту методику, можно использовать различных трансгенных животных для мечения других популяций флуоресцентных клеток, чтобы идентифицировать их взаимодействия как внутри спинного мозга, так и в других моделях заболеваний.
Обзор
В данном исследовании используется двухфотонная интравитальная визуализация для изучения взаимодействий между различными типами клеток спинного мозга на живой животной модели. В частности, основное внимание уделяется динамике микроглии и моноцитов в контексте травматического повреждения спинного мозга.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Визуализация in vivo
Теоретическая база
- Двухфотонная визуализация позволяет наблюдать за клеточными взаимодействиями в режиме реального времени.
- Химерные мыши по костному мозгу используются для дифференциации между резидентными клетками и клетками, происходящими из костного мозга.
- Травматические повреждения спинного мозга служат моделью для изучения клеточных ответов в сложной среде.
- Данный метод обладает преимуществами перед традиционными методами за счет сохранения естественной архитектуры ткани.
Цель исследования
- Наблюдение за перемещением и взаимодействием микроглии и моноцитов в поврежденном спинном мозге.
- Оценка поведения клеток в живом организме после травмы.
- Углубление понимания клеточной динамики при нейровоспалительных реакциях.
Используемые методы
- Создание химерных мышей с клетками костного мозга, помеченными флуоресцентными метками.
- Индукция раздавливания задних столбов спинного мозга.
- Мультифотонная визуализация для регистрации клеточных взаимодействий и перемещений.
- Послеоперационный мониторинг и визуализация в контролируемых условиях.
Основные результаты
- Успешная визуализация взаимодействий микроглии и моноцитов в режиме реального времени.
- Продемонстрировано перемещение клеток в области повреждения.
- Освещены преимущества визуализации in vivo по сравнению с традиционными методами.
- Получены данные о клеточных реакциях после травмы спинного мозга.
Выводы
- Двухфотонная визуализация является мощным инструментом для изучения клеточной динамики in vivo.
- Данное исследование расширяет понимание нейровоспалительных процессов при травмах спинного мозга.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для изучения терапевтических методов вмешательства.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод intravital-визуализации позволяет в режиме реального времени наблюдать за динамикой иммунных клеток при травматическом повреждении спинного мозга, что дает возможность раскрыть механизмы нейровоспалительных процессов. Дифференциация микроглии и макрофагов in vivo с помощью данного метода способствует валидации мишеней и снижению рисков при разработке иммуномодулирующих стратегий в доклинических моделях заболеваний ЦНС. Этот метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска новых препаратов, позволяя регистрировать клеточные взаимодействия в физиологически релевантной микросреде очага поражения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать паттерны инфильтрации и взаимодействия микроглии и макрофагов после раздавливания задних столбов спинного мозга.
- Практическая ценность: использование химерных моделей костного мозга позволяет дифференцировать резидентную микроглию ЦНС и макрофаги, происходящие из костного мозга, для специфического анализа целевых объектов.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет визуализации клеточных ответов в живой системе, что уменьшает зависимость от искусственных систем культивирования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные с временным разрешением о движении и взаимодействии клеток в области повреждения.
- Практическая ценность: создает воспроизводимую платформу визуализации для лонгитюдного отслеживания динамики иммунных клеток после травмы.
- Готовность анализа: обеспечивает стандартизированную визуализацию популяций CX3CR1-положительных клеток в качестве биомаркера воспалительной активации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует прогрессирование вторичного повреждения и инфильтрацию воспалительных клеток, имеющих значение для патологии спинного мозга человека.
- Практическая ценность: Облегчает проведение лонгитюдных сессий визуализации для оценки терапевтического воздействия на клеточную динамику в течение нескольких дней или недель.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап поиска мишеней с доклинической оценкой эффективности посредством использования согласованных фенотипических показателей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска маркеров нейровоспаления, обеспечивая раннюю валидацию мишеней с помощью фенотипического скрининга и позволяя проводить последующие исследования механизмов в доклинических моделях.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез об участии иммунных клеток при повреждении спинного мозга посредством прямого наблюдения за поведением микроглии и макрофагов.
- Скрининг: Предоставляет количественные данные визуализации, такие как скорость перемещения клеток, плотность инфильтрации и частота взаимодействий, для скрининга соединений.
- Аналитика: Позволяет получать пространственно-временные наборы данных для статистического сравнения клеточных фенотипов при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Соответствует стратегиям поиска биомаркеров путем отслеживания динамики CX3CR1-положительных клеток как коррелята нейровоспалительного ответа.
- Повторное использование в корпоративном секторе: Создает возможность многократного использования метода интравитальной визуализации, применимого к различным моделям заболеваний ЦНС, помимо повреждения спинного мозга.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в мишени за счет раскрытия механизмов нейроиммунных взаимодействий in situ.
- Операционная ценность: способствует воспроизводимости благодаря стандартизированным протоколам хирургической подготовки, стабилизации и визуализации.
- Стратегическая ценность: помогает в принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), снижая биологическую неопределенность в механизмах действия иммуномодуляторов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию терапевтических средств для ЦНС с учетом рисков на основе подтвержденного взаимодействия с мишенью в системах, релевантных заболеванию.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области хирургии на мышах, двухфотонной микроскопии и создания химер костного мозга.
- Необходим специализированный инструментарий, включая перестраиваемые лазеры, стабилизаторы спинного мозга и предметные столики для визуализации с контролем температуры.
- Требуется межфункциональное взаимодействие между хирургическими группами, специалистами по визуализации и персоналом по уходу за животными для обеспечения единообразия подготовки очагов поражения.
- При применении данной модели в других контекстах нейрональных повреждений или нейродегенеративных процессов требуются соответствующие адаптации.
- Метод ограничен периодом послеоперационного выживания и техническими сложностями поддержания стабильности спинного мозга при продольной визуализации.
