Candida Albicans биопленки развития на медицинской актуальных инородных тел в мышиной подкожной модели с последующим биолюминесценции изображений

Общей целью данного эксперимента является валидация использования штамма, экспрессирующего люциферазу, для неинвазивного мониторинга образования биопленки in vivo клетками Candida albican. Это достигается путем имплантации фрагментов катетера, колонизированных люциферазой, экспрессирующей штамм Candida albicans, в спину мыши. На втором этапе дрожжам позволяют расти в толстый слой клеток, встроенных во внеклеточный матрикс, создавая зрелую биопленку на внутренней стороне катетеров.

Далее добавляется субстрат, который будет преобразовываться ферментом люциферазой. Эта реакция производит измеримый свет: биолюминесцентная визуализация или BLI затем используется для регистрации и количественной оценки образования биопленки в живом хозяине. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими существующими методами, такими как центральная система Venmo, заключается в том, что мы можем протестировать до шести биопленок внутри одного животного, тем самым значительно сокращая количество животных, которые нам требуются для статистического анализа.

Применение этого метода распространяется на терапию образования биопленки candida albicans, поскольку наш метод позволяет легко тестировать существующие и новые противогрибковые компоненты. Кроме того, этот метод может дать представление о candida albicans, грибковых биопленках. Его также можно применять к другим микробам, таким как бактерии или другие забавные виды.

Предлагаемые процедуры легко реализовать в любой лаборатории, которая имеет доступ к животному помещению за 24 часа до хирургической процедуры, вскрывая упаковку, содержащую трехпросветные катетеры, в шкафу биологической безопасности. Используйте стерильный пинцет, чтобы удалить все ненужные части, и стерильный скальпель, чтобы разрезать часть, прикрепленную к катетеру. Затем подложите под пластиковый пакет линейку и разрежьте полиуретановый катетер на кусочки длиной в один сантиметр.

Затем заполните каждый катетер примерно 1,8 миллилитрами 100% эмбриональной бычьей сыворотки и инкубируйте кусочки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующее утро переложите каждый кусочек катетера, покрытого сывороткой, в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и соскребите C. albicans с планшета A YPD в один миллилитр PBS в отдельной микроцентрифужной пробирке в разведении от одного до 100. После подсчета разбавьте клеточную суспензию до конечной концентрации пять умно-10 на четвертую клетку на миллилитр.

И добавьте по одному миллилитру клеток к каждому из кусочков катетера, покрытого сывороткой. Дайте клеткам прилипнуть к катетерам в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем удерживая трубки в вертикальном положении стерильным пинцетом.

Аккуратно дважды промывайте каждый кусочек через просвет одним миллилитром PBS, чтобы установить катетеры. Начните с бритья нижней части спины восьминедельной самки мыши под наркозом, расположенной на грелке. Затем продезинфицируйте кожу и сделайте по одному небольшому разрезу от 0,5 до одного сантиметра с каждой стороны животного.

Далее рассекаем подкожный туннель ножницами, чтобы создать два подкожных тоннеля длиной около 1,5 сантиметра и шириной один сантиметр. Вставьте три части катетера в каждый туннель, следя за тем, чтобы части лежали рядом друг с другом в горизонтальном расположении, не перекрываясь. Закройте разрезы швами, а затем очень аккуратно очистите раны дезинфицирующим средством.

Затем нанесите местный анестетик непосредственно на разрезы и введите анестезиологическое средство, наблюдая за животными до полного выздоровления. Чтобы изобразить образование биопленки в соответствующий момент времени эксперимента, введите 100 микролитров свежеприготовленной спирали и терезина подкожно в каждую область, содержащую катетеры у животного, находящегося под наркозом. Затем выполняйте последовательные сканирования со временем регистрации от 20 до 60 секунд до достижения максимальной интенсивности сигнала.

Во время получения следующего кадра поместите интересующую область над каждым трио катетеров для измерения биолюминесцентной визуализации или интенсивности сигнала BLI ранее полученных кадров. Поместите прямоугольную область интереса фиксированного размера в область управления для измерения фонового сигнала в программном обеспечении для работы с живыми изображениями. Измерьте поток фотонов через области интереса для каждого трио катетеров, а также для фона.

После повторения этих измерений для каждого животного и в разные моменты времени формирования биопленки BLI сигнализирует об интенсивности каждого катетера в виде потока фотонов в секунду. Данные могут быть скопированы и вставлены непосредственно в программу для работы с электронными таблицами. В конце продольного эксперимента принесите в жертву каждому животному, разрезанному подкожной клетчаткой, и с помощью стерильного пинцета удалите фрагменты катетера один за другим.

Промойте катетеры два раза в одном миллилитре PBS, как только что продемонстрировано. Затем обработайте кусочки ультразвуком в новой микроцентрифужной пробирке в одном миллилитре свежего PBS при 40 000 герц на водяной бане. Проведите ультразвуковую обработку через 10 минут, поместите трубки с катетерами на лед и нанесите 100 микролитров исходных образцов в соотношении от одного до 10 и от одного до 100 разведений на агаровые пластины YPD.

В двух экземплярах. Наконец, построим график среднего значения и стандартного отклонения колониеобразующих единиц. И сигнал BLI для каждого животного в логарифмической шкале.

На этом изображении показано репрезентативное животное, демонстрирующее сигнал биолюминесценции вместе с областью интереса, обозначенной через шесть дней после развития биопленки. Обратите внимание на отсутствие сигнализации в области контрольного фона, подтверждающее ограничение биопленки участками, непосредственно прилегающими к катетерам, покрытым кандидой. В этом репрезентативном эксперименте можно наблюдать четкий сигнал BLI, продуцируемый биопленками люциферазы, в то время как штамм дикого типа, по-видимому, производит только фоновый сигнал.

Это увеличение сигнала следует той же тенденции, что и увеличение количества колониеобразующих единиц на биопленку и измерения потока фотонов для каждой группы животных, взятых вместе. Эти данные показывают, что BLI является мощным методом мониторинга и количественного определения in vivo формирования биопленки зрелых C. albicans в подкожной мышиной модели. После освоения инфекции устройств клетками кандиды может потребоваться два часа, в то время как имплантация катетера может быть сделана за 10 минут на мышь.

Визуализация BLI может быть выполнена за пять минут для каждой мыши. Большим преимуществом использования BLI является то, что вы можете неоднократно контролировать развитие биомассы и биопленки у одного и того же животного. Со временем после этой процедуры другие методы, такие как МРТ или КТ, могут предоставить информацию о точном положении собора.

Эта информация затем может быть использована для количественной оценки в более сложных моделях, таких как модель Кафедрального собора с глубокими жилами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться очень хорошее понимание того, как выполнять in vivo, подкожную биопленку, сс у мышей, и это может стать основой для дальнейшего углубленного анализа взаимодействий патогенов хозяина.