Генома белок-белковых Взаимодействие Скрининг белком-фрагментом комплементации анализа (РСА) в живых клетках

Общей целью данной процедуры является идентификация партнеров по взаимодействию с белком, представляющим интерес, с помощью анализа комплементации фрагментов белка DI гидрофолатредуктазы, или D-H-F-R-P-C-A. Это достигается путем предварительной конденсации трех коллекций DH FFR F или похвалы на массивах колоний высокой плотности. Далее производится прикормочный штамм с массивом похвалы на насыщенной среде.

На заключительном этапе отбираются диплоиды, полученные в результате этих спариваний. В конечном счете, восстановление DHFR количественно оценивается путем измерения размеров колонии на селективной среде PCA, которая дает сигнал, пропорциональный количеству комплекса приманки, восстановленного в клетках. Применение этого метода распространяется на терапию таких заболеваний, как рак, так как это происходит путем перестройки сетей взаимодействия белков.

Именно мутации могут привести к таким заболеваниям. Утром в день процедуры простерилизуйте роботизированную платформу, предварительно замочив инструменты PIN пять раз на 10 секунд в водяной бане, чтобы удалить любые остаточные комки клеток. Затем дважды замочите инструмент PIN вперед и назад на станции щетки и дважды на станции подачи so на 20 секунд каждый раз, чтобы удалить любые из оставшихся элементов во время очистки инструментов PIN.

Включите УФ-лампу на пять минут, чтобы простерилизовать робота. Затем после последней мойки просушите инструменты PIN-кодом на станции осушителя воздуха в течение 25 секунд. Конденсируйте коллекцию A-D-H-F-R на 16 массивов из 384 штаммов здесь.

Массив 384 может быть разделен на четыре квадранта с равным расстоянием, каждый из которых состоит из 96 позиций в матричной компоновке два на два, что в общей сложности составляет четыре квадранта. Чтобы сделать это для каждого массива 384, напечатайте четыре глицериновые пластины на четырех квадрантах омни-лотка, содержащего YPD плюс 250 микрограммов на миллилитр. Гигромицин В, используя для этого 96-контактный инструмент, вставляют 4 96-луночные планшеты, содержащие LDH FFR F три отрицательных контроля, между 60 глицериновыми пластинами из коллекции DHFR 3, чтобы получить окончательный набор из 64 пластин, которые точно заполняют четыре матрицы 1536.

Затем вставьте 4 96-луночные планшеты, содержащие LDH FFR F, три отрицательных контроля между 60 другими планшетами, чтобы получить окончательный набор из 64 пластин, которые точно заполняют 4 15 36 массивов перед добавлением ячеек к исходным планшетам, смочите стерилизованные штифты в 35 миллилитрах стерильной воды в омни-лотке в мокрой станции. Инкубируйте массивы при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух дней, а затем сконденсируйте коллекцию в четыре массива по 1536 штаммов. Выведите четыре массива по 384 деформации на каждой из четырех пластин назначения.

С помощью инструмента 384 pin. Стерилизация PIN-инструмента между каждым циклом репликации, как только что было продемонстрировано после еще одной двухдневной инкубации. Стандартизируйте размер колонии, воспроизведя четыре матрицы на выбранной среде YPD с помощью инструмента с усилием 1536 штифтов, и инкубируйте планшеты еще 48 часов.

Для высокой пропускной способности. D-H-F-R-P-C-A сначала инокулируют культуру приманочного штамма в 20 миллилитров жидкой жидкости YPD плюс рицин CIO в 50-миллилитровую пробирку и инкубируют клетки в течение двух дней при 30 градусах Цельсия с встряхиванием при 250 оборотах в минуту. Когда культура достигнет насыщения.

Поместите пять миллилитров клеточной суспензии на лоток YPD plus gnat omni и дайте клеткам впитаться на поверхности через пять-10 минут, удалите лишнюю жидкость и инкубируйте культуру при температуре 30 градусов Цельсия через два дня. Используйте инструмент 1 536 pin, чтобы распечатать штамм приманки на 12 пластинах YPD, используя каждую ячейку газона не более четырех раз. Затем с помощью инструмента 1, 536 pin, снова напечатайте соответствующий массив для коллекции DHFR F three поверх ячеек приманки.

Дайте штаммам спариться во время еще одной двухдневной инкубации, а затем выберите диплоидные клетки, напечатав колонии на омни-лотках, содержащих YPD плюс гидромицин B и нортин. Инкубируйте диплоиды еще два дня при температуре 30 градусов Цельсия, а затем повторите выбор, как только что продемонстрировали через день после начала инкубации. Залейте пластины средой, содержащей метотрексат, на следующий день.

Используйте инструмент 1 536 pin, чтобы напечатать диплоидные клетки на среде метотрексата и инкубировать планшеты еще четыре дня в пластиковых пакетах, чтобы предотвратить высыхание культур. На третий день инкубации. Залейте вторую партию омни-лотков со средой MTX, как только что было продемонстрировано на следующий день, включите свет робота и используйте роботизированную платформу для визуализации пластин, чтобы уменьшить фоновый рост штаммов PCA и увеличить количественное разрешение, реплицируйте клетки на второй партии среды MTX, чтобы выполнить второй раунд отбора MTX, как только что было показано.

Наконец, после получения изображений со второго набора пластин, проанализируйте массивы колоний с помощью соответствующего программного обеспечения, собирая информацию о размере колонии для каждой позиции каждого массива. Пороговое значение, определенное с помощью трех элементов управления LDH FFR F, может быть использовано в качестве эмпирического порога для определения попаданий с высокой степенью достоверности. Известные физические взаимодействия приманки могут быть затем извлечены из баз данных, таких как Biogrid, и наложены на данные.

Например, в данном случае пять из восьми попаданий с высокой достоверностью ранее были зарегистрированы как взаимодействующие NUP 82, среди которых другие NUP 16 и NUP 1 59 были определены как часть подкомплекса NUP 82. Данные также указывают на то, что приблизительный мембранный белок PEX 30 может представлять собой новый физический интерактив Nup 82, что подтверждено с использованием D-H-F-R-P-C-A при низкой пропускной способности, обнаруженной двумя другими партнерами по взаимодействию. Было установлено, что новый подкомплекс 20 и новый подкомплекс 85 не являются частью нового подкомплекса 82, что иллюстрирует способность D-H-F-R-P-C-A обнаруживать взаимодействия внутри и между подкомплексами более крупных комплексов.

При выполнении этой процедуры важно помнить об использовании носителя Freshly Report, чтобы избежать каких-либо неполадок с этапами печати, и включить необходимые элементы управления, чтобы убедиться, что конечный носитель PCA позволяет наращивать только клетки, демонстрирующие комплементацию DHFR.