Ближней инфракрасной (NIR) света увеличивается экспрессия маркера функции митохондрий у мышей вестибулярного сенсорного эпителия

Общей целью данного эксперимента является изучение потенциального нейропротекторного воздействия ближнего инфракрасного света на вестибулярный сенсорный эпителий мышей. Это достигается путем простого, кратковременного транскраниального воздействия ближнего инфракрасного света на мышей на различных стадиях развития. В качестве второго шага костные лабиринты обработанных животных рассекаются, что позволяет изолировать вестибулярный сенсорный эпителий.

Затем экспрессия гена-антиоксиданта, представляющего интерес, измеряется с помощью R-T-P-C-R для оценки влияния лечения на работу митохондрий. Наконец, проводится денситометрия для оценки влияния кратковременного воздействия ближнего инфракрасного света на экспрессию специфических антиоксидантных генов у мышей. Основное преимущество этой методики лечения в ближнем инфракрасном диапазоне заключается в том, что она проста и неинвазивна, что позволяет проводить дальнейший физиологический, молекулярный и поведенческий анализ после лечения.

Применение этого метода распространяется на потенциальную нейропротекцию периферической вестибулярной системы при нормальном старении или на улучшение сбалансированной работоспособности после вестибулярного заболевания или дефицита. За два-три дня до начала эксперимента сбрейте шерсть на голове и шее каждой мыши как можно плотнее, чтобы предотвратить повторное отрастание шерсти животного до завершения режима обработки. Чтобы сохранить у животных свободный от патогенов статус, очищайте инструменты с содержанием этанола 70% между каждой стружкой.

Затем в день лечения каждого животного-стажера возьмите мышь за проксимальный конец хвоста и дайте ей расслабиться на ладони, чтобы свести к минимуму стресс для животных, получающих лечение в ближнем инфракрасном диапазоне. Для каждого животного держите светодиодное устройство с яркостью 670 нанометров, на расстоянии одного-двух сантиметров от выбритого участка, и включите устройство на 90 секунд. Для фиктивной группы повторите процедуру обработки таким же образом, но с выключенным устройством для группы с блокировкой ближнего инфракрасного диапазона, обрабатывайте животных так же, как и для группы с ближним инфракрасным излучением, но с устройством, покрытым алюминиевой фольгой.

После повторения процедур для каждой группы с интервалом в 24 часа в течение пяти дней подряд заморозьте свежеприготовленную искусственную спинномозговую жидкость на основе глицерина или спинномозговую жидкость в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия на 45 минут до образования ледяной суспензии. Следующий. Для каждой мыши используйте закругленное лезвие бритвы под номером 22, чтобы сделать разрез вдоль сагиттальной кожи черепа, сохраняя сводчатый мозг черепа и лежащий под ним вестибулярный аппарат как можно более прохладным с помощью регулярного нанесения ледяного A CSF на ткани. Затем с помощью заостренной руки ножниц стандартного образца сделайте небольшой разрез в черепе в точке Лямбда и разрежьте вдоль сагиттального шва.

Затем осторожно проведите одну руку неглубокого URS под теменную кость, а затем закрепите и потяните теменную кость латерально и затылочную кость сзади, пока мозг не обнажится. Затем с помощью небольшого шпателя из нержавеющей стали приподнять мозг от передней и средней черепной ямки. Чтобы обнажить вестибулярный кохлеарный нерв, пересеките нерв, чтобы предотвратить ненужное напряжение первичных афферентных аксонов, которые непосредственно иннервируют вестибулярные волосковые клетки.

Затем полностью удалите мозг и осмотрите костный лабиринт, содержащий улитку и периферические вестибулярные органы в средней черепной ямке. Теперь сделайте два небольших разреза рядом с каждым костным лабиринтом и удерживайте и тяните передний полукруглый канал в сторону, чтобы иссечь всю конструкцию. Затем немедленно погрузите иссеченный лабиринт в чашку для препарирования, содержащую ледяной раствор спинномозговой жидкости, непрерывно перфузируя карбогеном.

Самая сложная часть этой процедуры заключается в получении постоянного количества жизнеспособной ткани для каждого животного; мы рекомендуем практиковать тщательное наблюдение и специфическое освещение ткани. Затем под стереомикроскопом удерживайте лабиринт у улитки и с помощью щипцов закрепите ткань на дне чашки с помощью прямых тонких щипцов. Процарапать небольшое отверстие в кости над передним полукружным каналом ула.

Затем протяните руку непосредственно под костью и проведите пальцем наружу от ULA, чтобы аккуратно увеличить отверстие. Продолжайте в том же духе до тех пор, пока не обнажится утрикула, передняя и боковая пула. Затем с помощью тонких щипцов осторожно приподнять ушку и пулю от костного лабиринта до тех пор, пока они полностью не отделятся.

Наконец, надежно захватите вестибулярные органы между кончиком щипцов и поместите их в свежеприготовленный лизис. Поместите буфер в микротрубку с завинчивающейся крышкой, аккуратно закрутите щипцы в буфере, чтобы отсоединить вестибулярные органы. Затем, убедившись, что щипцы очищены от ткани под стереомикроскопом, закрутите крышку микротрубочки и немедленно заморозьте образец в жидком азоте, чтобы сравнить воздействие лечения в ближнем инфракрасном диапазоне между молодыми и старыми мышами.

Мессенджер, РНК обратно, транскрибировали в комплементарную ДНК, затем анализировали экспрессию антиоксидантной супероксиддисмутазы 1 или СОД, измеренную с помощью денситометрии, наблюдалось значительное увеличение экспрессии бета-актина нормализовано в СОД более чем в два раза у молодых животных, получавших лечение в ближнем инфракрасном диапазоне, по сравнению с молодыми животными, получавшими фиктивное лечение, и молодыми животными, получавшими блокаду в ближнем инфракрасном диапазоне. Более старые животные, получавшие лечение в ближнем инфракрасном диапазоне, также продемонстрировали более чем двукратное повышение регуляции дерна по сравнению со старыми животными с блокировкой в ближнем инфракрасном диапазоне. После этой процедуры можно провести поведенческие, молекулярные или физиологические эксперименты, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: увеличивает ли ближний инфракрасный свет экспрессию других генов или белков в вестибулярном сенсорном эпителии?

Или ближний инфракрасный свет улучшает общую производительность равновесия у обработанных мышей?