Метод Изолированные Ex Vivo Легких перфузии в крысиной модели: уроки, извлеченные из Разработка EVLP программы Rat
25 февраля 2015 г.
Экс-Vivo легких перфузии (EVLP) позволило трансплантация легких у людей, чтобы стать более доступными, позволяя возможность оценить органы и расширению донорской бассейн. Здесь мы опишем развитие программы крыса EVLP и уточнений, которые позволяют воспроизводимым образцом для будущего расширения.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы создать согласованную модель перфузии легких на крысах, ex vivo, которая даст воспроизводимые результаты. Первым делом необходимо канюлировать трахею и начать искусственную вентиляцию легких. Далее проводится канюлирование легочной артерии и левого предсердия.
Заключительным этапом является удаление блокады сердечного легкого из грудной полости и помещение ее в контур перфузии легких ex vivo. В конечном счете, датчики давления, датчики веса и анализатор газов крови используются для отображения состояния легких в режиме реального времени путем измерения давления легочной артерии и других параметров. Изобилие легких ex vivo — это замечательная технология, которая позволила нам расширить пул доноров для трансплантации легких.
Мы ожидаем, что с помощью этой технологии, которая будет служить платформой для оценки органов, мы сможем улучшить качество органов, доставляемых для трансплантации, и общие результаты трансплантации. Здесь, в Медной лаборатории, мы придумали фразу «вооружение органа», то есть оценка, ремоделирование или ремонт, а затем модификация органа для улучшения качества и, таким образом, улучшения результатов трансплантации. Мы разработали надежную и воспроизводимую модель перфузии легких ex vivo на мелких крысах.
В этом видео мы продемонстрируем ключевые и критические шаги для разработки этой модели перфузии легких ex vivo, которая затем может служить платформой для исследований в области перфузии и трансплантации. Начните с настройки цепи EVLP и циркуляции теплого перфуза восемь по всей системе. Установите ванну с теплой водой, теплообменник и искусственную грудную клетку на 37 градусов Цельсия.
Пропустите газ дезоксигенации через PERFUSE eight в газовом фильтре, чтобы убедиться, что в нем содержится примерно 6% растворенного кислорода для эксперимента. После открытия программы сбора данных подключите датчик давления в легочной артерии, датчик трахеи, датчик дифференциального давления, датчик дыхательного потока, датчик дифференциального давления, датчик веса легких и датчик скорости насоса к коробке аналого-цифрового преобразователя. Наконец, установите операционный стол и подготовьте все операционные инструменты и расходные материалы, необходимые для процедуры.
После проверки седации по пальцам ноги, ущипнуть, поместить обезболиваемое животное в лежачее положение на операционном столе. Начните запись данных с помощью программы сбора данных. Когда все будет готово, войдите в брюшную полость и введите гепарин в нижнюю полую вену.
Следуя стандартным процедурам, канюльизируйте трахею и подключите канюлю к контуру вентиляции. Включите аппарат искусственной вентиляции легких, чтобы начать искусственную вентиляцию легких. Затем втяните грудную полость, чтобы обнажить легкие, стараясь не касаться их.
Удалите тимус и переместите содержимое брюшной полости в одну сторону, чтобы обнажить либо нижнюю полую вену, либо брыжеечную вену. После эвтаназии наложите шелковый шов за легочную артерию и аорту. При подготовке к закреплению канюли легочной артерии сделайте разрез в два-три миллиметра на передней поверхности выходного тракта правого желудочка и вставьте канюлю в основную легочную артерию.
Закрепите шелковым швом, удалите сгустки из легочной сосудистой сети, перфузируя примерно 15 миллилитров раствора электролита с низким содержанием калия через легочную артерию и через верхушку сердца. Далее расположите шелковый шов за сердцем и вокруг желудочков. Чтобы расширить митральный клапан и облегчить канюляцию, введите небольшую пару хирургических щипцов в верхушку через митральный клапан и в левое предсердие.
Когда все будет готово, вставьте канюлю в верхушку через митральный клапан в левое предсердие. Закрепите канюлю левого предсердия шелковым швом. Далее подключите канюлю легочной артерии к цепи ЭВЛП.
Убедитесь, что входная линия, идущая от цепи, загрунтована перфузом восьмеркой. Чтобы воздух не попадал в сердце и легкие, включите основной перистальтический насос и установите его на низкие обороты. Это позволит перфузе восьмерки пройти через легочную артерию и выйти из левого желудочка в грудную полость.
Следите за давлением в легочной артерии, чтобы убедиться, что оно не подскочит, что указывает либо на закупорку, либо на плохую канюляцию. Когда все будет готово, выключите перистальтическую помпу. Подключите канюлю легочной артерии к контуру перфузии легких ex vivo.
Не подключайте канюлю левого предсердия к цепи до тех пор, пока блокада сердца и легких не будет удалена из организма. Удалите блокаду сердечного легкого, пережав пищевод с помощью кровоостанавливающего средства и разрезав его ниже зажима, чтобы пищевод можно было использовать для тупого поднятия сердечно-легочных структур, рассеките окружающие ткани и перережьте нисходящую аорту и вспомогательные сосуды, чтобы освободить блок легких сердца, поднимая его через пищевод. Пересеките трахею, чтобы освободить сердечную блокаду легких, и поместите ее в указанное место на цепи ЭВЛП.
Затем подсоедините канюлю левого предсердия к линии оттока и запустите перистальтический насос. Для записи данных вентиляции и контроля давления необходимо быстро снять вентиляционную линию с верхней части аппарата ЭВЛП и прикрепить корпус с датчиками давления. Затем снова вставьте вентиляционную линию в верхнюю часть аппарата EVLP.
Убедитесь, что пузырьковая ловушка достаточно заполнена перфузой восьмеркой. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в легкие в течение первых 15 минут, медленно меняйте настройки вентиляции и перфузии до желаемых экспериментальных уровней. Увеличьте скорость перфузионного потока до желаемой скорости и давления во время этой начальной фазы наращивания.
Рекомендуется запрограммировать аппарат ИВЛ на прерывистые боковые вдохи, чтобы облегчить выведение жидкости из легочного пространства и отсрочить наступление отека. Определите нулевое время как время, когда параметры вентиляции находятся при положительном приливном объеме четыре миллилитра на килограмм. Конечное давление выдоха на двух сантиметрах.
H2O и параметры перфузии находятся на ожидаемом уровне и остаются постоянными. При желании возьмите восемь проб из порта пробы для мгновенной заморозки в жидком азоте и отметьте время отбора проб. Когда эксперимент будет завершен, изолируйте все необходимые анатомические фрагменты для сбора и либо заморозьте их в жидком азоте, либо поместите в фиксирующий раствор для дальнейших исследований.
Масса легких самцов крыс породы Sprague dolly существенно не изменялась в течение 60 минут перфузии легких ex vivo после первых 10 минут. Также не было изменений в давлении легочной артерии. Аналогичным образом, легочное сосудистое сопротивление не изменялось на протяжении всего исследования.
После 1 часа искусственной вентиляции легких при высоких дыхательных объемах и высоких пиковых концентрации провоспалительных цитокинов были увеличены в восьми пациентах PERFUSE, в то время как концентрации противовоспалительных цитокинов оставались неизменными. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о ключевых шагах, необходимых для создания модели обильности легких маленького животного ex Viva у крыс в вашей лаборатории.
Обзор
В данной статье описывается создание модели ex vivo перфузии легких (EVLP) крысы, направленной на улучшение результатов трансплантации легких. Эта модель позволяет проводить оценку состояния легких в режиме реального времени, тем самым расширяя круг потенциальных доноров.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология трансплантации
- Перфузия легких ex vivo
- Консервация органов
Теоретические основы
- Технология ex vivo перфузии легких позволяет более точно оценить состояние донорских легких.
- Она обладает потенциалом для улучшения результатов трансплантации за счет оценки качества органов.
- Разработка воспроизводимой модели на животных имеет решающее значение для развития исследований.
- Лаборатория Коппера стремится усовершенствовать методы оценки органов.
Цель исследования
- Создание стабильной модели крысы для эксвиво-перфузии легких.
- Оказание содействия исследованиям в области трансплантации легких и улучшения качества органов.
- Демонстрация критических этапов настройки модели EVLP.
Используемые методы
- Канюляция трахеи, легочной артерии и левого предсердия.
- Использование датчиков давления и системы сбора данных для мониторинга в режиме реального времени.
- Настройка системы теплой перфузии и поддержание физиологических условий.
- Пошаговое выполнение хирургических процедур по извлечению легких.
Основные результаты
- Успешное создание модели EVLP на крысах с воспроизводимыми результатами.
- Мониторинг состояния легких в режиме реального времени в процессе перфузии.
- Демонстрация методов улучшения качества органов для трансплантации.
- Потенциал данной модели для улучшения исходов трансплантации легких.
Заключение
- Модель EVLP на крысах является ценным инструментом для исследований в области трансплантации легких.
- Доработки данной модели могут привести к более точной оценке и лучшему сохранению донорских органов.
- Данное исследование вносит вклад в текущие усилия по повышению показателей успешности трансплантации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Создание воспроизводимой модели ex vivo перфузии легких (EVLP) крысы обеспечивает доклиническую платформу для оценки стратегий консервации легких и анализа качества органа перед трансплантацией. Эта модель позволяет механистически снизить риски при терапевтических вмешательствах, направленных на лечение повреждения легких, вызванного вентиляцией, и других патологий, имеющих значение для оптимизации донорских легких. Обеспечивая мониторинг легочных параметров в режиме реального времени, система повышает прогностическую достоверность рабочих процессов на ранних стадиях исследований, сосредоточенных на биологии трансплантации и восстановлении органов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся механизмов повреждения и восстановления легких в контролируемых условиях перфузии.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней, обеспечивая возможность оценки молекулярных путей в целостной системе органов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Предоставляет релевантную для изучения заболеваний систему подготовки валидированных биологических моделей для тестирования соединений, направленных на улучшение состояния легких.
- Практическая ценность: Способствует стандартизации анализа за счет измерения давления в легочной артерии, веса легких и параметров газового состава крови в режиме реального времени.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирование вентилятор-индуцированного повреждения легких (VILI) для оценки патофизиологических реакций и тестирования потенциальных стратегий по смягчению последствий.
- Операционная ценность: Обеспечение непрерывности процесса от этапа открытия до доклинической валидации путем поддержания физиологических условий во время перфузии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Модель EVLP на крысах интегрируется в континуум открытий, поддерживая проверку гипотез на ранних этапах биологических исследований, обеспечивая готовность анализа для скрининга соединений и предоставляя количественные данные для принятия решений о целесообразности дальнейшего продвижения на доклиническом этапе.
- Биология открытий: способствует снижению рисков при изучении механизмов путем уточнения роли сигнальных путей в процессах повреждения и восстановления легких.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели, такие как легочное давление и вес легких, для сравнения экспериментальных условий.
- Аналитика: позволяет осуществлять сбор данных в режиме реального времени с помощью датчиков давления, весовых преобразователей и анализа газов крови для оценки функции легких.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность доклинических исследований посредством моделирования VILI — патологии, имеющей клиническое значение при трансплантации легких.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для итерационного тестирования растворов для сохранения органов, стратегий вентиляции и фармакологических агентов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения неопределенности в ответных реакциях легких на вмешательства.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря четко определенным протоколам канюляции, перфузии и мониторинга.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений с учетом рисков в исследованиях по сохранению органов, снижая вероятность неудач на поздних стадиях разработки трансплантатов.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию кандидатов на основе функциональных исходов для легких, а не суррогатных маркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрососудистого канюлирования и знания анатомии сердечно-сосудистой и легочной систем на моделях грызунов.
- Зависимость от оборудования, включая перистальтические насосы, датчики давления, весовые сенсоры и анализаторы газов крови.
- Необходима межгрупповая стандартизация параметров перфузии, настроек аппарата ИВЛ и протоколов сбора данных.
- Требуется учет особенностей адаптации при переходе от моделей крыс к более крупным млекопитающим или при оценке легких человека.
- Существуют практические ограничения, такие как техническая сложность извлечения блока «сердце-легкие» и необходимость поддержания стерильности в процессе перфузии.
