И что нельзя делать крио-электронной микроскопии: учебник по пробоподготовки и высокое качество сбора данных для высокомолекулярных 3D реконструкции

Цель следующего эксперимента — получить возможность визуализировать макромолекулы в их замороженном гидратированном состоянии с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Это достигается путем мгновенного погружения сетки с образцом на криоген для получения тонкого остеклованного образца. На втором этапе образец подвергается воздействию электронного пучка, который сформирует проекционное изображение макромолекул.

Далее изображения обрабатываются на компьютере с целью получения 3D-реконструкции макромолекулы. Результаты показывают высокодетализированную трехмерную структуру макромолекулы, ее подтверждение и трехмерное расположение ее молекулярных партнеров. В этом и заключается основное преимущество этой методики, по сравнению с другими методами пробоподготовки для электромикроскопии.

В криотерапии изображение непосредственно формируется электронами внутри макромолекулы. Это более точно отражает его близкую к родной структуру. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение.

Подготовка криосетки и перенос в электронный микроскоп сложны в освоении из-за дополнительной сложности при работе при криогенных температурах, цикл прогрева используется в начале последовательности откачки и после криосеанса ЭМ. Чтобы начать эту процедуру, вставьте криодержатель в один из насосных портов насосной станции. Запустите опцию цикла прогрева.

В контроллере холодной ступени откройте дроссельную заслонку V two, а когда разрежение в турбонасосной станции стабилизируется и покажет показания от 10 до минус трех тур, или лучше откройте дроссельную заслонку V one. Как только температура в держателе стабилизируется выше комнатной и цикл прогрева завершен. Минимумы V один и остановите цикл.

Затем запустите опцию светового цикла и выберите необходимое время для достижения хорошего вакуума в диапазоне от одного до двух умножить на 10 до минус четырех тор. Когда вакуум достигнет 10 до минус трех для диапазона, откройте вакуумный клапан DU B три и клапан на криодержателе. Когда цикл завершен, поднимаются створки в порядке, обратном тому, в котором они были открыты.

С помощью пинцета оставьте кусочек слюды, чтобы обнажить две новые поверхности. Поместите новые открытые поверхности слюды лицевой стороной вверх на белый лист бумаги в чашку Петри. Поместив чашку Петри в банку с угольным испарителем, выполните последовательность откачки до тех пор, пока вакуум не опустится ниже 10 до минус шести и покройте слюду тонким слоем углерода.

Затем перенесите тонкий углерод в сетку. Этот кусок слюды размером 0,5 на один сантиметр покрыт и выведет углерод на плоскую поверхность отфильтрованной деионизированной воды. С помощью пинцета поместите святую карбоновую сторону сетки в контакт с верхней поверхностью плавающего слоя углерода и поднимите ее.

Поместите решетку карбоновой стороной вверх на предметное стекло размером 7,5 на 2,5 сантиметра, покрытое силовой пленкой. Затем поместите предметное стекло в камеру тлеющего оборудования и закройте камеру. Накачайте банку колокольчиком и засвечите.

Разряд в течение 20 секунд при 25 миллиамперах и семь раз по 10 до минус двух миллибар. На этом этапе включите погружной морозильный аппарат. Потяните емкость Итана вниз, заполнив резервуар жидким азотом.

Как только жидкий азот перестанет кипеть, поместите кончик трубки, поступающей из бака Итана, во внутреннюю камеру и очень медленно откройте клапан. Разжижьте этан во внутренней камере и заполните его до одного миллиметра сверху. Включите влажность.

Затем загрузите сетку на пинцет и загрузите от трех до пяти микролитров образца на углеродную поверхность святой решетки. Дождавшись, пока образец впитается в сетку, проведите промокание Чтобы добиться получения тонкого жидкого слоя румянца, заморозьте сетку, погрузив ее в жидкий этан. Осторожно снимите сетку пинцета в сборе с жидкого этана и перенесите его во внешнюю камеру, содержащую жидкий азот.

Затем переложите сетку в небольшой сетчатый ящик, погруженный в жидкий азот. На этом этапе вставьте криодержатель в рабочую станцию криопереноса. Наполните жидким азотом исполнитель криодержателя и емкость рабочей станции.

Быстро перенесите коробку криорешетки, содержащую замороженную гидратированную сетку, в жидкий азот на рабочей станции. Открыв коробку с криорешеткой, возьмите замороженную гидратированную сетку и поместите ее в слот для держателя образцов. Затем поместите зажимное кольцо на верхнюю часть сетки и осторожно нажмите на него тупым концом инструмента для зажимного кольца до тех пор, пока оно не будет прочно зафиксировано на месте.

Затем закройте криозатвор. Долейте ПЭМ против загрязнения жидким азотом. Снова наклоните предметный столик микроскопа до минус 60 градусов.

После этого начните цикл шлюзовой камеры PrepU на микроскопе. После того, как последовательность воздушных шлюзов насоса будет завершена, вставьте держатель хора в воздушный шлюз и подключите шнур управления холодной сценой к держателю для контроля температуры. После того, как красный свет погаснет, поверните держатель в положение нулевого градуса для его установки в высоковакуумную колонну T EM'S.

Втяните криозатвор и откройте клапаны колонны. Активируйте программу низкой дозы в режиме поиска. Центрируйте сцену и установите центрическую высоту с помощью альфа-воблера, чтобы раскачать сцену плюс-минус 15 градусов, выберите подходящее отверстие и разместите его в центре поля с помощью контроллера сцены XY.

Переключитесь в режим фокусировки и сфокусируйте изображение. Затем под фокусировкой получается изображение размером от 0,5 до 4,5 мкм. Переключитесь в режим экспозиции и запишите изображение.

Наконец, вернитесь в режим поиска, чтобы выбрать следующую лунку и повторить последовательность. Проведено сравнение микроскопических изображений, полученных методами негативного окрашивания и криоЭМ для четырех репрезентативных образцов с различными структурными характеристиками: отрицательно окрашенные аденоассоциированные вирусные капсиды выявляют вирусоподобные частицы, а криоЭМ показывает, что они пустые. На изображениях вируса табачной мозаики видны спиральные стержни с центральным каналом, заполненным красителем на негативном окрашивании и пустым на криоизображениях.

KLH собирается в характерные бочки, показывающие шесть бороздок как на негативном окрашивании, так и на изображениях cryo EM. Прямоугольные виды сбоку и круговые и насчет выявляют пустоту в структуре с помощью крио ЭМ в рецепторе запаха. Сложные поверхностные особенности, такие как центральный крест и центральное углубление, проявляются в виде накопления пятен при негативном окрашивании и в виде областей с более низкой плотностью при криоэмпинге.

Типичными примерами крио-ЭМ артефактов являются кристаллический лед, ледяное загрязнение, астигматизм и паутинистые структуры. Анализ одиночных частиц и 3D-реконструкция замороженного гидратированного инового рецептора выявили его четырехкратную симметричную структуру. Цитоплазматический домен образует квадратную призму и содержит несколько воспроизводимых угольных доменов, образующих каркасообразную структуру.

При разрешении 10 ангстрем можно визуализировать альфа-HELOCs в 3D. Разностное картирование может выявить положение важных лигандов. Подтверждающие изменения обеспечивают динамическое представление о макромолекуле.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить высококачественные криообразцы ЭМ. Cryo EM в сочетании с обработкой изображений позволил исследователям изучить структуру, организацию субъединиц и конформационную динамику высокомолекулярных машин.