Человек плюрипотентных стволовых клеток на основе Экспериментальная токсичность Анализы для химической безопасности Скрининг и системной биологии генерации данных

Общая цель данной процедуры заключается в описании двух тест-систем in vitro на токсичность для развития, основанных на исследованиях эмбриональных стволовых клеток человека и транскриптомных исследованиях. Это достигается путем первого культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток на эмбриональных фибробластах мыши. Второй шаг состоит в том, чтобы позволить человеческим эмбриональным стволовым клеткам сформировать тельца Эмбри, в которых они могут генерировать клетки всех трех зародышевых слоев, или дифференцировать их в нейроэктодермальные предшественники.

Затем тела эмбриона или нейроэктодермальные предшественники обрабатываются соединениями, представляющими интерес, в различных концентрациях во время дифференцировки. Заключительными этапами являются оценка жизнеспособности клеток и выделение РНК. В конечном счете, анализ микрочипов транскриптома используется для отображения изменений в экспрессии РНК клеток, обработанных представляющим интерес соединением, по сравнению с необработанными контрольными клетками. Основываясь на неоновых стволовых клетках человека и макрообластях ДНК, мы разработали методологию in vitro, позволяющую проводить мониторинг соответствующих для человека эффектов токсичности для развития.

Методология может быть применена фармацевтической и химической промышленностью для скрининга безопасности потенциальных лекарственных препаратов и токсикантов окружающей среды. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области токсичности для развития, такие как влияние химических веществ на самое раннее развитие нервной системы. Для начала разморозьте добавку со средой стволовых клеток при комнатной температуре и добавьте 100 миллилитров ее в 400 миллилитров среды базальных стволовых клеток.

Далее разморозьте матрицу базальной мембраны на льду, а затем добавьте дополненный объем матрицы в 24 миллилитра охлажденного дмм. F 12 базальную среду в соответствии с рекомендациями производителя перемешивают раствор путем аккуратного пипетирования вверх и вниз, а затем добавляют два миллилитра смеси в 12 отдельных шестисантиметровых пластин. Инкубируйте планшеты при комнатной температуре в течение часа, пока матрица покрывает планшеты.

Затем удалите среду и добавьте два миллилитра среды стволовых клеток. Далее извлеките четыре сливающиеся пластины из инкубатора, содержащего эмбрион человека. H девять клеток, выращенных на слоях питателя эмбриональных волокон мыши, которые подготовлены, как описано в сопроводительном протоколе под стереоскопом, используют наконечник пипетки объемом в один миллилитр и удаляют дифференцированные колонии из планшета.

Недифференцированные колонии имеют четко очерченные границы, а клетки компактны, в то время как дифференцированные клетки начинают распространяться от границ, и их клетки становятся больше по размеру. Отсадите среду и промойте клетки четырьмя миллилитрами PBS. Затем добавьте два миллилитра среды для стволовых клеток с помощью восьмерки стереоскопа.

Разрежьте колонии на шесть-девять частей каждая с помощью иглы 26 калибра и соскребите комки одним миллилитровым наконечником пипетки. Аккуратно соберите срезанные колонии в 50-миллилитровую соколиную пробирку и гранулируйте их по 200 г в течение пяти минут. Далее аспирируйте снат и ресуспендируйте клетки в 12 миллилитрах среды стволовых клеток.

Поместите 20 микролитров клеточной суспензии на предметное стекло и подсчитайте количество комков под микроскопом. Отрегулируйте концентрацию суспензии до 150 комков на миллилитр, а затем добавьте по два миллилитра суспензии в каждую шестисантиметровую пластину. Перемещайте планшеты вперед и назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки, а затем инкубируйте планшеты в инкубаторе для клеточных культур через день.

Осторожно меняйте среду После удаления дифференцированных колоний добавьте 40 микролитров стерильного раствора 5%-ного блок-сополимера в каждую лунку планшета Vbo 96 и дайте ему инкубироваться при комнатной температуре в течение 45 минут. Извлеките из инкубатора конфлюентную пластинку, содержащую колонии, и выберите все дифференцированные колонии под стереомикроскопом с помощью наконечника для пипетки объемом в один миллилитр. Затем отсадите среду из тарелки и аккуратно промойте клетки четырьмя миллилитрами PBS.

Далее добавьте в каждую тарелку по два миллилитра среды случайной дифференцировки. Используйте инструмент для прохода, чтобы разрезать колонии девяти клеток H на комки одинакового размера. Соскребите комки скребком для клеток и аккуратно соберите их в центрифугу для соколиной пробирки объемом 50 миллилитров.

Колония скапливается при 200 G в течение пяти минут, а затем отсасывает снат и ресуспендирует клетку и среду случайной дифференцировки в концентрации 1000 сгустков на миллилитр. Далее отсасывайте блок-сополимер из V-образной нижней 96-луночной пластины С помощью многоканальной пипетки добавьте по 100 микролитров колонийной суспензии в каждую лунку, агрегируйте комки до дна V-образных лунок, центрифугируя пластину при четырех градусах Цельсия в течение четырех минут при 400 G. Затем поместите планшет в инкубатор на четыре дня, используя более широкий диаметр 200 микролитров. Извлеките тела эмбрионов из 96-луночной пластины и поместите их в стерильную квадратную пластину размером 122 миллиметра.

Затем с помощью стерильной серологической пипетки объемом 10 миллилитров перенесите тела эмбриона из квадратной пластины в соколиную пробирку объемом 15 миллилитров. Дайте телам эмбриона осесть в течение двух минут, а затем аспирируйте и промойте тела эмбрионов пятью миллилитрами PBS. Опять же, подождите, пока тела эмбриона осядут в течение двух минут, а затем аспирируйте надосадочную жидкость.

На этот раз тела эмбриона ресуспендируют в пяти миллилитрах среды случайной дифференцировки. Далее перенесите тела эмбриона в 10-сантиметровую бактериологическую пластину и добавьте дополнительно 10 миллилитров случайной дифференцировки. Терпимая. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в горизонтальном шейкере.

При 50 оборотах в минуту репрезентативные тела эмбрионов демонстрируются на пятый, девятый и 14-й день. Осторожно меняйте среду через день, заменяя все 15 миллилитров на свежие случайные дифференцировки. Терпимая. Чтобы оценить влияние препарата на дифференцировку, начните добавлять препарат в среду на пятый день в течение 10 дней, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

С помощью стерильной пипетки соберите тела эмбриона из 10-сантиметровых пластин в соколиную пробирку объемом 15 миллилитров. Дайте им отстояться в течение двух минут, затем аспирируйте надосадочную жидкость. Промойте их пятью миллилитрами PBS и переложите в безнуклеазную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Дайте им успокоиться и аспирируйте подъем сната. Суспензируйте тела эмбриона в одном миллилитре триольного реагента и пропустите раствор через иглу 24 калибра с помощью одномиллилитрового шприца примерно 15 раз, чтобы разрушить клетки. Далее добавьте по 200 микролитров хлороформа в каждый образец.

содержимое вихрем, а затем центрифугируйте образцы при 12 000 G в течение 15 минут При четырех градусах Цельсия соберите надосадочную жидкость в пробирки объемом 1,5 миллилитра, не потревожив ни один из других слоев. Затем добавьте равный объем охлажденного 70% этанола в надосадочную жидкость и аккуратно перемешайте содержимое, встряхивая. Перелейте 700 микролитров смеси в мини-спин-колонку и следуйте инструкциям производителя по очистке РНК на заключительном этапе элюирования.

Нанесите 22 микролитра воды, не содержащей нуклеаз, на спиновую колонну и центрифугируйте пробирки при 12 000 G в течение одной минуты. Затем снимите пробирку для сбора и положите РНК на лед. Добавьте один миллилитр предварительно теплого дискового пространства на слияние T 25 колбы с девятью клетками H и инкубируйте колбу в течение девяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем добавьте два миллилитра предварительного тепла. Промойте среду до вытесненных обработанных клеток и аккуратно пипетируйте вверх и вниз пять раз пятимиллилитровой пипеткой. Переложите раствор ячейки в соколиную трубку.

Далее промойте колбу девятью миллилитрами промывочной среды и добавьте ее в тюбик с ячейками. Соберите свои клетки в течение трех с половиной минут при 500 G. Затем удалите сны и повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах промывочной среды. Снова ФТ клеток в течение трех с половиной минут при 500 G, а затем удалите супнатант и ресуспендируйте клетки в четырех миллилитрах среды эмбриональных стволовых клеток человека, добавьте 0,5 мл клеточной суспензии и 4,5 мл свежей среды в свежую колбу PBS с промывкой T 25, содержащую митотически инактивированные эмбриональные фибробласты мыши.

Меняйте среду в колбе каждый день. Смазывайте 10-сантиметровую тарелку 0,1% желатина в PBS и выдерживайте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем соберите эмбриональные стволовые клетки человека, удалив среду, и добавьте один миллилитр acuta в колбу T 25, пока клетки отделяются.

Добавьте 6,6 миллилитров холодной среды в 330 микролитров замороженной матрицы базальной мембраны. Отфильтруйте раствор через сетчатое фильтр 40 микрометров и используйте один миллилитр отфильтрованного раствора, чтобы покрыть каждую лунку шестилуночного планшета. В дальнейшем клетки будут нанесены на покрытые покрытием планшеты после 30-минутной инкубации эмбриональных клеток человека с Аккутаном, реакция будет остановлена добавлением 1,5 миллилитров среды Гесса.

Соскребите ячейки из колбы, а затем добавьте еще восемь миллилитров среды Гесса. Получите раствор для одной клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью фильтрующего элемента пипетки объемом 10 миллилитров через сетчатый фильтр 40 микрометров, а затем центрифугируйте клетки в течение трех минут при 500 G, удалите надосадочную жидкость S и повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах клеток со средним спином снова на три минуты при 500 G. Затем удалите надосадочную жидкость и reus. Суспендируйте клетки в 10 миллилитрах среды Hess S, содержащей ингибитор горных пород Y 2 7 6 3 2 при конечной концентрации 10 микромоляров.

Затем удалите надосадочную жидкость из посуды, покрытой желатином, клеточную суспензию на чашку, покрытую желатином, и инкубируйте ровно один час при температуре 37 градусов Цельсия. Во время этих этапов гипопласт оседает на пластинах, покрытых желатином, где эмбриональные стволовые клетки человека остаются свободными. Время плавания имеет решающее значение, так как длительная инкубация приведет к слипанию стволовых клеток, а короткая инкубация удалит только некоторые из этих фибробластов, когда фибробласты прикрепятся.

Используйте среду в пластине, чтобы аккуратно смыть неадгезивные стволовые клетки с пластины. Промойте планшет во второй раз 10 миллилитров среды Hess и объедините клетки, центрифугируйте клетки в течение трех минут при 500 G, удалите образовавшуюся S-надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки примерно в четырех миллилитрах кондиционированной среды, содержащей 10 микромоляров ингибитора горных пород Y 2, 7, 6, 3, 2 и 10 нанограммов на миллилитр фактора роста фибробласта два. Далее смешайте клетки с триановым синим и подсчитайте их в пластине гемоцитометра.

18 000 клеток на квадратный сантиметр на плите перед подвалом. Пластины с мембранным покрытием покрывают клетки 1,5 миллилитрами среды на лунку и инкубируются при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через 24 часа обновите среду Еще через 24 часа смените среду на свежую кондиционированную среду с добавлением всего 10 нанограммов на миллилитр фактора роста фибробластов через 2 72 часа.

После посева клеток смените среду на нокаутирующую среду для замены сыворотки. Этот момент времени называется нулевым днем дифференциации. Обновляйте клетки свежей средой каждый день в течение следующих трех дней.

При смене среды на четвертый и пятый день добавляйте состоящую из 25% N две добавки среды и 75% нокаутную замену сыворотки. Среду на шестой день собирают клетки для анализа. Тела эмбрионов могут быть использованы для многих различных исследований.

Вот пример исследования цитотоксичности, показывающее влияние различных концентраций метилртути на жизнеспособность клеток. Из этого графика было определено, что точка 24 микромоляра вызывает 10% гибели клеток, а концентрация 1,61 микромоляра вызывает 50% гибели клеток после воздействия в течение 14 дней. РНК, выделенные из тел эмбрионов трех групп лечения метилртутью, были запущены на микрочипе для изучения широкого спектра биомаркеров.

Те, кто подвергся воздействию точки 25 микромолярной ртути, показаны красным цветом. Те, кто подвергся воздействию одной микромолярной метилртути, показаны синим цветом, а контрольная РНК — зеленым. Эта карта компонентного анализа показывает, что генетические характеристики каждой группы лечения значительно отличаются от других: в общей сложности более 276 генов были модифицированы более чем в два раза при воздействии одной микромолярной концентрации метилртути.

30 из этих генов также были модифицированы группой с более низкой концентрацией в точке 25 микромоляров. На этой тепловой карте можно видеть, что 233 гена, модифицированных в одной микромолярной группе лечения, были генами, которые были подавлены, и только 43 были повышены в результате лечения. Не забывайте, что работа с триазолом или развивающимися муравьями может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует учитывать такие меры предосторожности, как ношение септи защитных очков, химически стойких ручных перчаток и выполнение всех работ, связанных с триолом в вытяжном шкафу.

Следуя этой процедуре. Другие методы, такие как окрашивание, образование фероса, которые могут смешивать формирование трубки, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как фенотипическое закрепление.