Подготовка и Respirometric Оценка митохондрий, изолированных от скелетной мышечной ткани, полученные чрескожной пункционной биопсии

Общей целью этой процедуры является изучение контроля дыхания в митохондриях, выделенных из биопсированной скелетной мышечной ткани. Это достигается путем предварительного получения небольшого количества мышц с помощью чрескожной пункционной биопсии. Второй шаг заключается в выделении митохондрий из биопсируемой мышцы путем гомогенизации.

Затем выделенные митохондрии промывают и отделяют от немитохондриальных фракций путем центрифугирования и пропускания образца через марлю. Последний шаг заключается в том, чтобы изолировать изолированные митохондрии для выполнения респирометрического анализа с помощью анализов внеклеточного потока для визуализации скорости потребления кислорода. В конечном счете, анализатор внеклеточного потока морского конька используется для изучения контроля дыхания в изолированных митохондриях.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что она требует минимального количества мышечной ткани всего 20 миллиграммов и ограничивает межэкспериментальную вариабельность. Эти особенности делают этот метод пригодным для применения в клинических исследованиях. Последствия этого метода заключаются в диагностике митохондриальной дисфункции у пациентов.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку биопсия мышц и выделение митохондрий требуют точных манипуляций, которые лучше всего продемонстрировать визуально, а не только описать в тексте. Для проведения биопсии локально введите 1% лидокаина, стараясь не проникнуть в мышцу. После этого следует 10-минутный период ожидания.

Чтобы обеспечить достаточное онемение, возьмите биопсию из средней области мышцы между введением и исходом, избегая субфасциальных и миосухожильных областей. Чтобы добиться этого, сначала используйте чрескожную иглу и следуйте фасциальному щелчку или сопротивлению фасции в качестве ориентира. Оцените глубину с помощью иглы для анестезии, затем прощупайте ее узким лезвием скальпеля и сделайте четырех-пятимиллиметровый разрез через фасцию.

Продвигайте иглу через разрез до тех пор, пока она не будет введена в мышцу. Соберите несколько образцов с окном, повернутым в разные стороны. Применяйте непрерывное отсасывание с помощью шприца объемом 60 кубических сантиметров, продвигая и выводя образцы мышц в чрескожную иглу два-четыре раза в разных направлениях.

Прекратите отсасывание и извлеките иглу. Попросите помощника сильно надавить на место прокола в течение пяти минут. Для установления гемостаза следует отсоединить иглу от всасывающей трубки и аккуратно извлечь мышечные образцы из окна и бочки.

Сделайте второй проход, если требуется больше мышц, повторив эту процедуру. Удалите все видимые сгустки крови из мышечного образца с помощью щипцов. Затем взвесьте образец и сразу же поместите в пробирку со льдом.

Холодные ECCOs фосфатно-солевые буферные или DPBS. Удалите видимую соединительную ткань из образца с помощью острых ножниц и пинцета. Тщательно. Промойте образцы три-четыре раза ледяным буфером DPBS.

Чтобы удалить кровь, храните образцы на ледяном DPBS и обрабатывайте как можно скорее. В течение 45 минут после биопсии примите меры предосторожности, чтобы осторожно удалить любые сухожилия или жировую ткань из мышечного образца. Удалите небольшую часть лишней салфетки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Это может быть использовано для других экспериментов, таких как вестерн-блоттинг. Сразу же измельчите мышечную ткань на мелкие кусочки. С помощью стерильной пары ножниц затем суспендировать по 500 мкл до одного миллилитра ингибитора сикстинского белка АПФ, такого как нагары, растворить в ЦП один буфер в концентрации 0,2 мг на грамм ткани.

Пропустите пробу через мясорубку до тех пор, пока она не станет хорошо взвешенной. После этого следует пятиминутная инкубация при комнатной температуре перед перекладыванием на лед, убедившись, что гомогенизатор тщательно промыт. Заранее. Гомогенизируйте фарш, обработанный нагарами.

С помощью автоматизированного гомогенизатора. Держите образец на льду на протяжении всего процесса. Гомогенизируйте каждый образец ткани четыре раза каждый раз в течение двух секунд.

С помощью автоматического гомогенизатора при скорости 10 000 об/мин поместите образец обратно на лед. Промойте зонд 70% этанолом, а затем дистиллированной водой между салфетками. Теперь промойте гомогенизированную ткань равным объемом часовни Perry one или CP one buffer.

Затем промойте салфетку с удвоенным объемом СР и двумя буферами. Добавьте балансировочную трубку, доведя воду до того же объема в другой конической трубке. Соберите содержимое в центрифужную пробирку и центрифугуйте при температуре 600 GS при четырех градусах Цельсия или за 10 минут предварительно намочите марлю, чтобы все частицы прошли и не попали на ткань.

Пропустите надосадочную жидкость через марлю, собрав фильтрат и отбросив гранулы, тем самым удалив большую часть немитохондриальных фракций. Затем ультрацентрифугируйте надосадочную жидкость при 10 000 GS при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Суспензируйте гранулу в четырех миллилитрах CP два буфера перед центрифугированием во второй раз таким же образом после центрифугирования.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте паштет в двух миллилитрах СР одного буфера. На этом этапе поместите небольшую аликвоту из этой суспензии в отдельную пробирку, которая будет использоваться для оценки белка. Восстановите, суспензируйте оставшуюся пробу в СР в одном буфере и центрифуге.

Как и раньше, обратите внимание, что белковая пластина должна быть настроена в соответствии со стандартами на более ранних этапах центрифугирования. Наконец, повторно суспендируйте конечную гранулу в минимальном количестве раствора или массы митохондриального анализа. Выполните анализ XF для визуализации скорости потребления кислорода или OCR в пикомолях кислорода в минуту или абсолютных уровнях кислорода и pH.

В выводе данных. Добавьте 10-кратную концентрацию соединений в одной массе X к портам от A до D пластинчатого респирометра, чтобы получить окончательную концентрацию, указанную в текстовом протоколе. Подготовьте достаточный объем составов для необходимого количества скважин.

Используйте расчеты белка, измеренные ранее, чтобы определить концентрации митохондрий, которые необходимо добавить. Определите оптимальное количество митохондрий, титруя один микрограмм, 2,5 микрограмма и пять микрограммов митохондрий на лунку. Из 24 лунок планшет для минимизации изменчивости между скважинами.

Сначала разведите 10 х митохондрий в холоде, одну х масса плюс субстрат. Далее в каждую лунку доставьте по 50 микролитров этой суспензии. Оставляем четыре лунки, содержащие всего 50 микролитров массы, для использования в качестве фоновых показаний.

Поместите предварительно замоченную калибровочную пластину вместе с верхним картриджем в респирометр для выполнения калибровки прибора. Готовясь к испытанию планшета, запустите его центрифугой при температуре 2000 GS в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования.

Аккуратно добавьте 450 микролитров одной массы, плюс сукцинат и гнилую известную каждому. Хорошо рассмотрите митохондрии под микроскопом, чтобы убедиться в однородном прилегании к лунке, прежде чем передавать планшет в анализатор XF. Последовательно. Измерьте митохондриальное дыхание в режиме реального времени с помощью респирометра, запрограммировав его с использованием настроек респирометра, предоставленных в текстовом протоколе, показанном здесь, являются типичными метрическими профилями респиро, основанными на комплексе два с использованием одного микрограмма, 2,5 микрограмма и пяти микрограммов митохондрий, как и ожидалось.

В целом, OCR увеличивается при большем количестве митохондрий. Расчетный коэффициент контроля дыхания или RCR для этого анализа составляет 7,95, что указывает на высокое качество митохондриального препарата для сравнения согласованности результатов при профилировании различных объемов митохондрий Был проведен анализ вариантов или Inova и рассчитана сумма квадратов. Сумма квадратов или SS представляется для состояний два, состояний три, несвязанных антимицинов А и RCR для состояний два и состояний три в одну сторону.

Иннова была статистически значимой, а также для антимицина и RCR. Не было замечено существенной разницы для третьего состояния, несвязанного между группами. Эти результаты показывают, что пять микрограммов митохондрий на лунку дают самый низкий SS по сравнению с другими концентрациями.

Этот график служит ориентиром для указания того, сколько митохондриального белка можно ожидать на основе исходного размера мышечной выборки. Как и ожидалось, существует сильная корреляция между количеством обработанных мышц и общим содержанием митохондриального белка в конечном образце. После освоения этой техники она может быть выполнена менее чем за три часа, если она выполнена правильно.

После биопсии мышц важно убедиться, что пациент не принимает аспирин или ибупрофен или другие безрецептурные нестероидные препараты в течение следующих трех дней, чтобы обеспечить хорошее заживление тканей, которые мы биопсировали. Далее, мы хотим убедиться, что они не будут заниматься какой-либо напряженной деятельностью в течение следующих полутора дней, чтобы ничего не раздражало. Это был бы баскетбольный батут, но они могут заниматься своими обычными делами.

Мы также просим, чтобы они сохраняли область сухой в течение 24 часов, но в первый раз, когда она намокнет, примите душ, чтобы любые виды бактерий, которые могут быть на коже, которую мы не очистили, не попали в разрез. После просмотра этого видео у вас должно быть лучшее понимание того, как проводить биопсию S-латеральной скелетной мышечной ткани, изолировать митохондрии и измерять контроль дыхания.