Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации мембранных белков, экспрессируемых в SIA coli, для последующего структурного и функционального анализа. Сначала бактерии собирают, лизируют и анализируют методом SDS-PAGE для визуализации правильно свернутых белков GFP с помощью флуоресценции InGel. На втором этапе масштабируют культивирование штаммов E. coli, в которых подтверждена экспрессия интересующих мембранных белков, и готовят общую фракцию мембран из клеток после индукции экспрессии белка.

Наконец, общая фракция мембран сольбилизируют в четырех различных детергентах, после чего монодисперсность сольбилизированных белков GFP анализируют методом эксклюзионной хроматографии. В итоге белки отслеживают по флуоресценции, а профили элюции строят для оценки агрегации, монодисперсности и содержания свободного GFP в образцах.

Производство рекомбинантных мембранных белков для структурных и функциональных исследований остается технически сложной задачей из-за их низкой растворимости и нестабильности после экстракции детергентами. Опыт показал, что скрининг нескольких вариантов мембранных белков, например ортологов из разных видов, может повысить вероятность успешной экспрессии мембранного белка. Для контроля правильности фолдинга используется слияние с зелеными флуоресцентными белками.

Первым этапом нашего протокола на основе GFP для скрининга экспрессии мембранных белков в e coli является использование внутригелевой флуоресценции лизатов целых клеток в детергентах для идентификации конструкций мембранных белков для дальнейшего анализа на основе уровня экспрессии при скрининге. Затем поведение выбранных мембранных белков в различных детергентах оценивается с помощью флуоресцентного детектирования в сочетании с эксклюзионной хроматографией. Это позволяет получить информацию о монодисперсности белково-детергентных комплексов. Для анализа бактериальной экспрессии, индуцированной IPTG, начните с переноса одного миллилитра e coli, обработанной IPTG, из дубликатов в 24-луночных глубоких планшетах overnight-культуры в 96-луночные глубокие планшеты, запечатайте планшеты и затем осадите клетки центрифугированием в течение 10 минут при 6 000 ×g при комнатной температуре.

После этого переверните блок, чтобы слить среду, аккуратно промокнув его бумажным полотенцем для удаления остатков жидкости. Снова герметично закройте планшет и через 20 минут или более поместите клетки на хранение при температуре -80 °C. Разморозьте пеллеты в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем с помощью многоканального дозатора полностью ресуспендируйте клетки в 200 µL лизирующего буфера.

Обработайте клетки 20 µL раствора DLPI при перемешивании со скоростью 1000 RPM и температуре 4 °C в течение 10 минут. Затем добавьте по 25 µL 10% DDM в каждую лунку и инкубируйте клетки еще 60 минут при перемешивании. После обработки DDM центрифугируйте блок с глубокими лунками, затем перенесите 10 µL очищенного лизата в микротитрационный планшет и добавьте 10 µL буфера для нанесения образцов на SDS-PAGE гель.

Теперь внесите в каждую лунку геля по 10 µL буферного раствора лизата и проведите электрофорез при постоянном напряжении от 100 до 120 вольт в холодном помещении в течение 2–2,5 часов, пока граница раздела не достигнет нижней части геля. Поместите гель в систему визуализации с синим светофильтром для обнаружения гибридных белков с целью масштабирования клеточных культур. После трансформации компетентных клеток E. coli выберите колонию и перенесите её в 10 мл питательного бульона для инкубации в течение ночи при 37 °C.

На следующее утро разбавьте 5 мл ночной культуры в 500 мл среды power broth и продолжите выращивание культур при перемешивании со скоростью 250 RPM и температуре 37 °C. Когда OD при 595 нм достигнет примерно 0.5, индуцируйте экспрессию, добавив IPTG до конечной концентрации 1 мМ, после чего поместите культуру обратно в шейкер на ночь, на этот раз при температуре 20 °C. На следующее утро соберите клетки путем центрифугирования и храните осадки при температуре -80 °C.

Для подготовки клеточных мембран снова суспендируйте осадок, выдержанный при комнатной температуре, в 5 мл PBS на грамм клеточного осадка, увеличивая объем по мере необходимости, пока вязкость не снизится до текучей консистенции. Затем добавьте к клеткам хлорид магния до конечной концентрации 1 мМ, ДНК до конечной концентрации 10 мкг/мл и одну готовую таблетку ингибитора протеаз на 20 г клеточного осадка.

Затем разрушьте клетки с помощью охлажденного гомогенизатора при давлении 30 KPSI, после чего осадите неразрушенные клетки и клеточный дебрис путем центрифугирования в течение 15 минут при 30 000 ×g и температуре 4 °C. Перенесите супернатант в ультрацентрифужную пробирку и выделите общую фракцию мембран, центрифугируя супернатант в течение одного часа при 200 000 ×g и температуре 4 °C. Затем с помощью гомогенизатора ресуспендируйте осадок мембран в 10 мл ледяного PBS для солюбилизации мембран с использованием каждого из выбранных детергентов.

Перенесите по 900 µL суспензии мембран в полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем добавьте по 100 µL каждого свежеприготовленного детергента в соответствующие пробирки объемом 1,5 мл и инкубируйте смеси при температуре 4 °C при слабом перемешивании. Через час осадите детергентные и растворимые фракции с помощью настольной ультрацентрифуги, убедившись, что пробирки заполнены как минимум наполовину, и сохраните супернатант для анализа методом эксклюзионной хроматографии с флуоресцентным детектированием (FEC).

Затем используйте колонку для эксклюзионной хроматографии Equator с широким диапазоном фракционирования, пропуская через нее рабочий буфер со скоростью 0,3 milliliters per minute. Затем внесите 100 microliters solubilized membrane sample в колонку с той же скоростью потока и отслеживайте профиль элюции с помощью флуоресцентной оптики. В завершение импортируйте данные об объеме элюции и интенсивности флуоресценции в программу для работы с электронными таблицами для графического отображения и проанализируйте оставшийся solubilized membrane material с помощью флуоресценции в геле.

Как было показано ранее, указанное семейство белков необходимо для деления бактериальных клеток. На данных изображениях представлена репрезентативная флуоресцентная визуализация в геле 24 из 47 упомянутых конструктов. Интенсивность полос указывает на уровень экспрессии.

Например, химерный белок в дорожке четыре хорошо экспрессируется в обоих штаммах. Однако наличие дополнительных полос с меньшей молекулярной массой указывает на частичную деградацию белка во многих дорожках. Присутствует полоса, размер которой соответствует отдельному GFP.

Например, G four и H four полностью расщепляются до свободного GFP в штамме C 41 DE three P lies S. В то же время в LEMO 21 DE three в этих графах присутствует некоторое количество интактного белка. Анализ двух конструктов, показавших хорошие результаты при первичном скрининге с помощью эксклюзионной хроматографии с флуоресцентным детектированием, демонстрирует, что белки ведут себя по-разному в зависимости от того, какое из четырех детергентов тестировалось.

Например, для этого белка в системе Dool Multiside наблюдался только симметричный пик с незначительной агрегацией, что позволило выбрать данный детергент для последующей очистки. Напротив, другой слитый белок демонстрировал схожий профиль во всех протестированных детергентах. Данный протокол может быть легко расширен, чтобы включить, например, различные штаммы e coli, выращенные в разных условиях экспрессии, а также дополнительные детергенты как для первичного, так и для вторичного скрининга.

Резюмируя, основной целью данного протокола является возможность проведения скрининга большого количества мембранных белков на предмет экспрессии и солюбилизации детергентами для выявления кандидатов для дальнейшего анализа.