Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в Кишечная палочка

Общей целью этой процедуры является идентификация мембранных белков, экспрессируемых в SIA coli для структурного и функционального анализа. Сначала бактерии собираются, ложатся и анализируются на странице SDS для визуализации правильно свернутых белков GFP с помощью флуоресценции Ингеля. На втором этапе продукцию кишечной палочки, определенной для экспрессии представляющих интерес мембранных белков, увеличивают и получают общую мембранную фракцию из клеток после индукции экспрессии белка.

Наконец, общая мембранная фракция растворяется в четырех различных моющих средствах и монодисперсности моющего средства. Солюбилизированный. Белки GFP анализируются с помощью эксклюзионной хроматографии. В конечном счете, белки можно контролировать с помощью флуоресценции и построения элюцианских профилей для оценки агрегационной монодисперсии и свободного GFP в образцах.

Производство рекомбинантных мембранных белков для структурных и функциональных исследований остается технически сложным из-за их низкой растворимости и нестабильности после экстракции в детергенты. Опыт показывает, что скрининг нескольких вариантов мембранных белков, таких как ортологи от разных видов, может повысить вероятность успешной экспрессии мембранных белков. Слияние с зелеными флуоресцентными белками, используемыми для сообщения о подлинном сворачивании.

Первым шагом в нашем протоколе на основе GFP для скрининга экспрессии мембранных белков и кишечной палочки является использование флуоресценции ингеля лизатов детергентов из целых клеток для идентификации конструкций мембранных белков для дальнейшего анализа на основе уровня экспрессии в экране. Это дает информацию о монодисперсности белковых комплексов детергента. Для анализа индуцированной ППТГ бактериальной экспрессии начните с переноса одного миллилитра обработанного ИПТГ дубликата колина из 24 глубоких колодцевых блоков в 96 глубоких луночных блоков, запечатайте блоки, а затем раскрутите клетки в течение 10 минут при температуре 6000 G при комнатной температуре.

После этого переверните блок, чтобы сцедить носитель, осторожно постукивая по бумажному полотенцу, чтобы слить остатки жидкости. Снова запечатайте пластину и храните элементы при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее чем через 20 минут. Разморозьте гранулы в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем с помощью многоканальной пипетки полностью суспендируйте клетки в 200 микролитрах буфера для лизиса.

Обрабатывайте клетки 20 микролитрами раствора DLPI при встряхивании при 1000 оборотах в минуту и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем добавьте в каждую лунку по 25 микролитров 10%-ной доды и высиживайте клетки еще 60 минут с встряхиванием. После обработки ДДМ центрифугой, глубокую лунку блокируют, а затем переносят 10 микролитров очищенного лизата в планшет для микротитрования и добавляют 10 микролитров буфера для загрузки геля страницы SDS.

Теперь загрузите в гель 10 микролитров буферного раствора лизата на лунку и запустите гель при постоянном напряжении от 100 до 120 вольт в холодном помещении в течение двух-2,5 часов, когда диафрагма достигнет дна. Поместите гель на имидж-сканер с фильтром синего света, чтобы обнаружить гибридные белки для масштабирования клеточных культур. После преобразования Eloqua компетентной кишечной палочки выберите колонию в 10 миллилитров бульона для ночного роста при температуре 37 градусов по Цельсию.

На следующее утро разведите пять миллилитров ночной культуры в 500 миллилитрах бульона и продолжайте выращивать культуры при встряхивании при 250 об/мин и 37 градусах Цельсия. Когда OD на 595 нанометрах составляет примерно 0,5, индуцируйте экспрессию, добавив IPTG до конечной концентрации в один миллимоляр, а затем поместите культуру обратно в шейкер на ночь, на этот раз при температуре 20 градусов Цельсия. На следующее утро соберите клетки методом центрифугирования и храните гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Подготовить клеточные мембраны. Повторно суспендируйте третьи гранулы комнатной температуры в пяти миллилитрах PBS на грамм клеточной гранулы, увеличивая объем по мере необходимости до тех пор, пока вязкость не уменьшится до жидкой консистенции. Затем добавьте в клетки хлорид магния до конечной концентрации одного миллимоляра ДНК до конечной концентрации 10 мкг на миллилитр и одну расфасованную таблетку ингибитора протеазы на 20 г клеточной гранулы.

Затем вскройте ячейки с помощью охлажденного разрушителя ячеек под давлением 30 KPSI, а затем гранулируйте неповрежденные ячейки и мусор в течение 15 минут при температуре 30 000 G и четырех градусах Цельсия. Перенесите супинат в ультрацентрифужную трубку и соберите общую мембранную фракцию, вращая супинат в течение одного часа при температуре 200 000 раз G и четырех градусах Цельсия. Затем используйте гомогенизатор клеток для повторного суспендирования мембранной гранулы в 10 миллилитрах ледяного PBS для растворения мембран для каждого используемого моющего средства.

Аликвоту 900 микролитров мембранной суспензии в 1,5 миллилитровую полицентрификаторную пробирку. Затем добавьте по 100 микролитров каждого свежеприготовленного моющего средства в соответствующие 1,5 миллилитровые пробирки и инкубируйте смеси при температуре четыре градуса Цельсия при умеренной растительности. Через час измельчите моющее средство и растворимые фракции с помощью настольной ультрацентрифуги, убедившись, что пробирки заполнены не менее чем наполовину и сохраняют лежачий агент для флуоресцентной эксклюзионной хроматографии или анализа FEC.

Далее идет колонна исключения размера экватора с широким диапазоном фракционирования с буфером потока со скоростью 0,3 миллилитра в минуту. Затем вводят 100 микролитров растворенного мембранного образца в колонку с той же скоростью потока и контролируют элюцианский профиль с помощью флуоресцентной оптики. Наконец, импортируйте данные об объеме и интенсивности люминесценции в программу для работы с электронными таблицами для графического отображения и проанализируйте оставшийся растворимый материал мембраны с помощью флуоресценции ингела.

Как было показано ранее, указанное семейство белков имеет важное значение для деления бактериальных клеток. На этих изображениях показан представитель в гелевофлуоресцентной визуализации 24 OUTTA 47 указанных конструкций. Интенсивность полос дает представление об уровне выражения.

Например, гибридный белок в четвертой полосе хорошо экспрессируется в обоих штаммах. Тем не менее, дополнительные полосы с более низкой молекулярной массой позволяют предположить, что белок частично деградирует во многих направлениях. Существует полоса, которая по размеру соответствует только GFP.

Например, G 4 и H 4 полностью расщеплены до свободного GFP в C 41 DE три P lies S деформации. В то время как в тройке LEMO 21 DE на этих графиках присутствует некоторое количество интактного белка. Анализ двух конструкций, которые показали хорошие результаты в первичном скрининге с помощью исключения из размера, обнаруженного флуоресценцией, демонстрирует, как белки ведут себя по-разному в зависимости от того, какие из четырех моющих средств были протестированы.

Например, этот белок давал только симметричный пик с агрегацией помета в Dool Multiside, что делало его предпочтительным моющим средством для последующей очистки. Напротив, другой гибридный белок продемонстрировал аналогичный профиль во всех протестированных моющих средствах. Этот протокол может быть легко расширен за счет включения, например, различных штаммов кишечной палочки, выращенных в различных условиях экспрессии, и дополнительных сдерживающих факторов как в первичном, так и во вторичном скрининге.

Таким образом, основная цель данного протокола заключается в том, чтобы обеспечить возможность скрининга большого числа мембранных белков с точки зрения экспрессии и детергентизации с целью выявления кандидатов для дальнейшего анализа.