Оценка ветвления дендритов в зубчатой ​​извилине гиппокампа области у мышей

Общей целью данного эксперимента является изучение степени дендритной арборизации в гиппокампе мышиной модели. Это достигается с помощью двух различных методов. В первом методе дендриты трассируются вручную в режиме реального времени по всей толщине каждого сечения.

После трассировки можно реконструировать и проанализировать все дендритное дерево. Использование веерных диаграмм позволяет использовать анализ различных веерных диаграмм, полученных от разных мышей, в качестве объективного средства сравнения. Второй метод заключается в визуализации дендритной арборизации с помощью визуализации с увеличенной глубиной резкости.

Наконец, панорамный метод используется для сшивания нескольких изображений с большим увеличением вместе, чтобы получить одно составное изображение с высоким разрешением для качественной и количественной оценки дендритов во всей интересующей области. Исследования AMI вытекают из моей лаборатории. Основным преимуществом этих методик перед существующими металлами является простота использования и скорость получения и сбора данных.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как оценка дендритизации в пораженных областях мозга и оценка влияния различных методов лечения на дендриты. При этой процедуре, через день после того, как мозг мыши был зафиксирован в 4%-ном альдегиде, поместите его в раствор сахарозы для обезвоживания на 48 часов при четырех градусах Цельсия. Извлеките мозги из сахарозы и поместите их прямо на медные блоки, помещенные на сухой лед.

Заполните блок ОКТ и отметьте ориентацию мозга, используя обонятельную луковицу в качестве ориентира. Разрежьте участки толщиной 70 микрон при температуре минус 20 градусов Цельсия с помощью криостата, поместите их в раствор криопротектора и держите при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования. Инкубируйте секции в перекиси водорода в метаноле в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим их прогревом до 37 градусов Цельсия в TBS в течение получаса.

Инкубируйте срезы с 0,3% тритоном и обычной лошадиной сывороткой в течение 45 минут при комнатной температуре перед окрашиванием антителом DCX на следующий день. Промойте срезы три раза подряд в TBS и инкубируйте срезы с биотинилированным антиго для лошади в течение двух часов при комнатной температуре. Промойте секции три раза подряд в TBS по 10 минут каждая и инкубируйте их со светом B, C в течение 1,5 часов.

При комнатной температуре добавьте в раствор DAB перекись водорода и немедленно инкубируйте срезы в этом растворе в течение пяти минут и завершите реакцию, промыв их три раза ледяным TBS с последующим одним способом. Стирать в ТТ БС при комнатной температуре. Обезвожьте секции с помощью ряда растворов этанола.

По пять минут каждый очистить и ксилол, а затем накрыть слипом с помощью DPX. После того как срезы полностью высохнут, острым лезвием очистите излишки DPX на предметных поверхностях и поместите их на сканирующий столик микроскопа по одному. Система визуализации состоит из микроскопа, оснащенного джойстиком сканирующего столика, и 12-битной цветной камеры.

Далее запустите программу neuro lucita и откройте новый файл данных. Разместите точку отсчета на экране, щелкнув в любом месте указателем мыши, чтобы активировать все значки с панели инструментов окна программы. Затем нажмите на значок джойстика на панели инструментов и используйте джойстик, чтобы найти зубчатую извилину гиппокампа.

В первом разделе во вкладке инструментов окна программы выберите диспетчер последовательных разделов. Нажмите на значок нового раздела в левом нижнем углу окна, чтобы открыть окно настройки последовательного раздела. После этого выберите окно настройки последовательного участка и введите общее количество разделов, содержащих области гиппокампа.

Затем выберите интервал оценки и введите толщину сечения. Начните обводить область зубчатой извилины, нажав на значок рисования контура свободной руки на панели инструментов. Впоследствии наметьте зубчатый зернистый слой клеток.

Выберите 100x в меню увеличения. Затем добавьте каплю иммерсионного масла на секцию и переключите объектив на 100 х. Найдите дендатные гранулярные тела клеток и дендриты под этой целью.

Затем сосредоточьтесь на выбранном нейроне, и нажмите на значок трассировки нейронов. На панели инструментов проведите контур окружности тела клетки зубчатой гранулы. Когда трассировка будет завершена, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать готовое тело ячейки.

Теперь начните вручную отслеживать дендриты и направления X, Y и Z, а затем следуйте за каждой ветвью с помощью джойстика и ручки Z-мотора. В раскрывающемся меню проследите каждую из ветвей, которые выходят из этих узлов в конце каждой ветви. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите окончание в выпадающем меню.

С помощью значков клавиш со стрелками в окне программы. Случайным образом выберите другую зубчатую гранулярную ячейку и повторите процедуру трассировки, как показано на рисунке. Сохраните всю трассировку.

Теперь запустите neuro lucita explorer для анализа нейронов. Откройте первый файл данных NRX с первой мыши экспериментальной группы. Добавьте файл NRX второй мыши экспериментальной группы и продолжайте до тех пор, пока не будут добавлены все файлы NRX из этой группы.

На вкладке анализа выберите веер на диаграмме, чтобы открыть окно веера в анализе, установите флажок дендриты и нажмите кнопку Отображать для ссылок и ветвящихся шаблонов дендритов для этой группы мышей. В этой процедуре подключите микроскоп к цифровой камере. Поместите секцию на сканирующий столик, подключенный к микроскопу, и переключитесь на объектив с 10-кратным увеличением.

Далее переместите рабочую область в интересующую область. Запустите программу захвата видео и нажмите кнопку записи. Как только кнопка записи будет нажата, используйте ручку макрофокусировки для перемещения сверху вниз раздела в течение четырех секунд Прежде чем сохранить полученный видеофайл, используйте бесплатную программу Image J для преобразования видеофайлов a VI в несжатый формат.

Запустите программу анализа изображений и откройте файл VI. Перейдите в меню процесса и нажмите на расширенную глубину резкости. Выберите соответствующий видеофайл в опциях вывода.

Выберите «Создать составное изображение наилучшего фокуса» в параметрах анализа фокусировки. Выберите параметры нормализованного освещения и максимального локального контраста. Затем нажмите кнопку «Создать», чтобы создать результирующее изображение, представляющее все сфокусированные пиксели по оси Z.

После этого сохраните полученное изображение. На этом шаге поместите секцию на сканирующий предметный столик, подключенный к микроскопу. Переместите рабочую область в интересующую область.

Затем запустите программу получения изображений с помощью объектива с 10-кратным увеличением, получите и сохраните изображения с высоким разрешением из интересующей области, убедившись, что перекрытие между изображениями составляет не менее 10%. Затем запустите редактор композитных изображений, чтобы сшить изображения впоследствии. Перейдите в меню «Файл» и нажмите на новую панораму.

Выберите папку, в которой хранятся изображения. Далее выберите изображения, которые принадлежат одному региону, и нажмите Ok. Нажмите кнопку экспорта на диск и сохраните изображение.

Это изображение представляет собой изображение области интереса с чрезвычайно высоким разрешением, которое может быть использовано для анализа. На этом рисунке показана визуализация дендритной арборизации с использованием методов EDFI и без них. Традиционный метод нахождения наилучшей плоскости фокусировки сравнивался с EDFI и значительно более высокими значениями площади дендритов.

С помощью метода EDFI были найдены. Здесь показана количественная оценка длины и объема, занимаемых дендритами в различных порядках ветвления. Максимальная длина и объем были достигнуты в заказном.

Вот гистограмма дендритной длины зубчатых гранулярных клеток. Большинство дендритных сегментов DCX окрашенных DDR имели длину от 13 до 26 лет. Эта красная пунктирная линия показывает нормальное распределение данных, представленных в соответствии с этой процедурой.

Другие классические методы, такие как neuro Lucid, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы относительно объема и площади, занимаемой дендритами. Этот метод, который мы показали вам, очень поможет исследователям в области нейробиологии не только оценить структуру нейронных структур, но и оценить ненейрональные мелкие структуры, такие как микроглия в толстых срезах мозга. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценить масштаб нейронных проекций за относительно короткий промежуток времени.