Экспериментальная Глаукома индуцированная глазной инъекций магнитных микросфер
2 февраля 2015 г.
Мы представляем метод индуцирования повышенного внутриглазного давления (ВГД) путем введения магнитных микросфер в глаз крысы для моделирования глаукомы. Это приводит к сильному повышению давления и обширной гибели нейронов. Этот протокол прост в выполнении, не требует повторных инъекций и дает стабильные длительные подъемы ВГД.
Целью этой процедуры является индуцирование повышенного внутриглазного давления у крысы с помощью инъекции парамагнитных микросфер в переднюю камеру глаза. Сначала поместите магнитное кольцо вокруг глаза животного, находящегося под наркозом, промойте магнитные микросферы, снова суспендируйте их в растворе, а затем загрузите их в шприц. Затем введите магнитные микросферы в переднюю камеру глаза.
Снимите магнитное кольцо во время восстановления. Данные процесса, полученные в результате гистологических анализов, таких как туннельное окрашивание или окрашивание зрительного нерва, могут измерить гибель ганглиозных клеток сетчатки в результате повышенного внутриглазного давления. Стерилизованные магнитные микросферные шарики размером восемь микрон промыть три раза в одном миллилитре буферизованного солевого раствора Хенка методом reus, суспендируя и центрифугируя при 10 000-кратном G в течение пяти минут.
Затем суспензируйте в 0,5 миллилитрах HBSS по 30 миллиграмм на миллилитр раствора. Теперь, используя сонометр с отскоком, откалиброванный для использования на глазу крысы, проведите пять исходных измерений ВГД у бодрствующих животных. После обезболивания крысы наносят глазную мазь на неоцененный контралатеральный глаз, чтобы сохранить его влажным.
Во время анестезии на операционный глаз вводят 0,5% пропана гидрохлорид, местный анестетик. Далее промойте этот глаз 5%-ным повидон-йодом в воде. Через пять минут отключите повидон-йод и промойте глаз 0,9%-ным стерильным физиологическим раствором.
Поддерживайте влажный глаз во время анестезии с регулярным применением стерильного физиологического раствора. Теперь поместите стероидный магнит вокруг глаза, чтобы свести к минимуму риск травмы радужной оболочки и свести к минимуму потерю бусин. Ориентируйте иглу по касательной к поверхности роговицы как можно более параллельно радужной оболочке.
Приступайте к введению 25 микролитров по 30 миллиграмм на миллилитр, гамма-облученные магнитные микросферы в переднюю камеру. Оставьте иглу на месте на одну минуту после инъекции, чтобы убедиться, что шарики оседают в углу роговицы IOC, препятствуя оттоку воды из трабекулярной сетки. Слегка наклоните иглу через несколько секунд после того, как шарики первоначально осядут, чтобы обеспечить некоторую утечку воды и свести к минимуму временное повышение внутриглазного давления.
Чтобы обеспечить непрерывное использование иглы в отдельных процедурах, промойте иглу PBS. Затем 70% этанола, за которым следует дистиллированная вода на этом этапе. При необходимости снимите магнит и с его помощью втяните бусины в участки неполного покрытия.
Оставьте магнит на месте вокруг глаза еще на 10 минут после инъекции. Чтобы бусины хорошо прилегали к углу роговицы радужной оболочки. Обратная анестезия с использованием 0,25 мг на килограмм гидрохлорида ESOL.
Вводите 0,5 пропана гидрохлорида для обезболивания и мазь левомицетикола местно для профилактики инфекции. Оставьте животных восстанавливаться на тепловом коврике, пока они не восстановятся в движении. Затем переложите в теплую коробку.
Используйте контралатеральный глаз в качестве нерейтингового контроля. Повторяйте измерения ВГД каждые два-три дня после введения шариков и каждые два-три дня после этого, определите критерии для включения глаз в исследования, в том числе ВГД повышено над контралатеральным контрольным давлением на пять миллиметров ртутного столба, и ВГД не превышает 60 миллиметров ртутного столба. Тем не менее, при желании можно повторно ввести бусины в глаза, в которых не развивается высокое ВГД.
Зафиксируйте рассеченные глаза и зрительный нерв в 4%-ном паральдегиде, оценив повреждение нейронов сетчатки путем туннельного окрашивания и повреждение зрительного нерва с помощью туинового синего. Окрашивание. В этом эксперименте введение магнитных шариков в угол роговицы постоянно вызывало длительное и устойчивое повышение давления. Кроме того, увеличение давления сохранялось на протяжении всего эксперимента.
Среднее значение ВГД, усредненное по всей длине эксперимента для контрольных глаз без инъекции бусины, составило 19,7 плюс минус 0,3 мм ртутного столба и 40,5 плюс минус 2,8 мм ртутного столба для глаз с инъекцией бусин. Кроме того, пиковое значение ВГД увеличилось с 22,8 плюс минус 0,3 мм ртутного столба до 49,9 плюс минус 2,3 мм ртутного столба, чтобы определить, приводит ли повышение ВГД к гибели ганглиозных клеток сетчатки. Туннельное окрашивание проводили на сетчатке и гистологию на поперечных участках зрительного нерва в сетчатке.
Мы наблюдали увеличение туннельного окрашивания в глазах, введенных бусинами, с повышенным ВГД. Количество ядер апоптоза увеличилось примерно в 15 раз по сравнению с контралатеральной контрольной гипертензивной сетчаткой, как и ожидалось в глазах, в которые магнитные шарики вводились без давления, количество туннельных положительных клеток существенно не отличалось от таковых у контрольной группы, введенных без инъекций. Дальнейшее исследование патологии зрительного нерва на модели глаукомы показало накопление одинового синего цвета во многих аксонах, что указывает на дегенерацию этих клеточных процессов.
Обзор
В данной работе представлен метод индуцирования повышенного внутриглазного давления (ВГД) у крыс путем введения магнитных микросфер в переднюю камеру глаза для моделирования глаукомы. Эта процедура приводит к значительному повышению давления и гибели нейронов, обеспечивая стабильный и длительный рост ВГД без необходимости повторных инъекций.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Офтальмология
- Исследования глаукомы
Теоретические сведения
- Повышенное внутриглазное давление (ВГД) является основным фактором риска развития глаукомы.
- Современные модели часто требуют проведения нескольких вмешательств.
- Магнитные микросферы предлагают новый подход к индуцированию ВГД.
- Понимание механизмов гибели нейронов при глаукоме имеет решающее значение для разработки методов лечения.
Цель исследования
- Создать надежную модель глаукомы у крыс для проведения исследований.
- Оценить влияние повышенного внутриглазного давления (ВГД) на гибель ганглионарных клеток сетчатки.
- Оценить долгосрочные эффекты инъекций магнитных микросфер на ВГД.
Используемые методы
- Инъекция парамагнитных микросфер в глаз крысы.
- Измерение ВГД с помощью рикошетного тонометра.
- Гистологический анализ повреждений сетчатки и зрительного нерва.
- Оценка апоптотической гибели клеток с помощью TUNEL-окрашивания.
Основные результаты
- Значительное и стойкое повышение ВГД в глазах, в которые вводились микросферы.
- Усиление гибели ганглиозных клеток сетчатки, коррелирующее с повышенным ВГД.
- Гистологические признаки дегенерации зрительного нерва.
- В контрольных глазах на протяжении всего исследования поддерживался нормальный уровень ВГД.
Выводы
- Данный метод эффективно моделирует глаукому у крыс.
- Повышенное ВГД приводит к значительным повреждениям нейронов.
- Эта модель может быть использована для дальнейших исследований глаукомы и тестирования терапевтических средств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает создание надежной и воспроизводимой модели для индукции стойкого повышения внутриглазного давления у крыс, что позволяет проводить механистические исследования патофизиологии глаукомы. Модель способствует валидации мишеней, связывая повышение давления с гибелью ганглионарных клеток сетчатки и дегенерацией зрительного нерва, что обладает прогностической ценностью для скрининга нейропротекторных терапевтических средств. Простота модели и длительный эффект снижают вариабельность экспериментов, облегчая кросс-функциональное взаимодействие в процессах поиска и разработки лекарств.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первоначальный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать причинно-следственную связь между внутриглазным давлением (ВГД) и глаукомой путем индукции устойчивого повышения давления.
- Практическая ценность: обеспечивает стабильный фенотип для оценки воздействия на мишени в патогенных путях.
- Научная ценность: способствует функциональной валидации мишеней, участвующих в регуляции трабекулярной сети и динамике водянистой влаги.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные показатели ВГД и гистопатологические данные для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимые измерения базового и повышенного ВГД для проведения кампаний по скринингу соединений.
- Научная ценность: Позволяет проводить оценку зависимости «доза-эффект» для препаратов, снижающих ВГД, посредством продольного мониторинга давления.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Воспроизводит основные патологические изменения при глаукоме, включая апоптоз ганглионарных клеток сетчатки и дегенерацию аксонов зрительного нерва.
- Практическая ценность: Облегчает доклиническую оценку нейропротекторных соединений и препаратов, модулирующих IOP, в системе, релевантной данному заболеванию.
- Научная ценность: Способствует согласованию биомаркеров посредством корреляционного анализа уровней IOP и показателей гибели нейронов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная модель вписывается в континуум разработки препаратов для лечения глаукомы — от валидации мишени и поиска перспективных соединений до тестирования доклинической эффективности, что подтверждается ее способностью вызывать измеримое повышение IOP и последующую нейродегенерацию.
- Открытийная биология: позволяет проверить гипотезы о механизмах патологии сетчатки и зрительного нерва, вызванных повышением ВГД.
- Скрининг: использует ВГД в качестве фармакодинамического биомаркера для оценки влияния соединений на отток водянистой влаги.
- Аналитика: обеспечивает количественные измерения ВГД и гистопатологические конечные точки для сравнительного анализа состояний.
- Трансляционные исследования: связывают повышение ВГД с нейродегенерацией, имеющей значение для человека, обеспечивая трансляционную преемственность.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую платформу для индукции ВГД, адаптируемую для различных моделей грызунов при проведении лонгитюдных исследований.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую уверенность в причинно-следственной связи между ВГД и глаукомой за счет устойчивого повышения давления и нейродегенерации.
- Практическая ценность: Гарантирует воспроизводимость результатов благодаря стандартизированным методам инъекции микросфер и магнитного позиционирования.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок за счет снижения биологической вариативности в исследованиях эффективности препаратов на основе ВГД.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию терапии глаукомы с учетом рисков, основываясь на профилях снижения ВГД и нейропротекции.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт проведения окулярных операций на грызунах и измерения ВГД методом рикошетной тонометрии.
- Зависит от наличия стерильных магнитных микросфер, оборудования для стерилизации и реагентов для гистологического окрашивания.
- Необходимо межкомандное согласование критериев повышения ВГД и протоколов гистологической оценки.
- Требует учета особенностей анатомии глаза мыши и меньшего объема передней камеры.
- Ограничено необходимостью послеоперационного мониторинга для исключения случаев транзиторного повышения давления и обеспечения воспроизводимости модели.
