Дифференциация человеческих нервных стволовых клеток линии на трехмерной культур, анализ микроРНК и предполагаемые гены-мишени

Общая цель данного эксперимента заключается в оценке дифференцировки микроРНК, профилировании и валидации Mr.NA мишени линии нейральных стволовых клеток человека. Это достигается путем первого культивирования нервных стволовых клеток человека в трехмерной системе культивирования для индуцирования дифференцировки клеток. Второй шаг заключается в количественной оценке дифференцировки путем измерения роста аксонных отростков.

Затем изменения в экспрессии микроРНК оцениваются с помощью микроматрицы R-N-A-P-C-R. Затем выполняется вычислительный анализ выбранных дифференциально экспрессируемых микроРНК для идентификации набора предполагаемых мРНК-мишеней. В конечном счете, целевые мРНК проверяются с помощью репортерной плазмиды, трансфекции и двойного анализа люциферазы.

Таким образом, метод, который будет представлен здесь, может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронных стволовых клеток, такие как характеристика экспрессированных микроРНК, и они нацелены на матричные РНК в нейронных стволовых клетках человека, когда они подвергаются дифференцировке. Тем не менее, этот метод может дать представление о биологии нейронных стволовых клеток. Он также может быть применен к другим системам стволовых клеток, таким как мезенхимальные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или другие системы, требующие индукции дифференцировки и молекулярной характеристики.

Визуальная демонстрация этого метода разбивает критические этапы дифференцировки линии нейро-стволовых клеток человека, а исследование профилирования микроРНК и валидация мишени мРНК демонстрируют участие в этой процедуре в лавании, ученый из моей лаборатории. Вся эта процедура должна выполняться в шкафу биологической безопасности с использованием асептических методов. Восстановите гидратацию каркасов, добавив в каждую лунку AL VX 12.

В лунку налейте два миллилитра 70% этанола, приготовленного с использованием воды для полива. Избегайте прикосновения к каркасам, выдавая 70% этанол по стенке каждого из них. Хорошо тщательно отсадите 70%-ный этанол и сразу же промойте скаффолды двумя миллилитрами на лунку D-M-E-M-F 12 в течение одной минуты.

Повторите процедуру промывки дважды, осторожно отсасывайте D-M-E-M-F 12 после окончательной промывки. Покройте каркасы, добавив по два миллилитра ламинина в D-M-E-M-F 12 на каждый. Хорошо инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, увлажненном углекислым газом с 5% углекислым газом, в течение как минимум двух часов.

Далее промойте планшет теплым D-M-E-M-F 12 семенами на каждый каркас примерно 500 000 нейральных стволовых клеток человека или H. nscs в объеме 150 микролитров среды RMM с факторами роста. Инкубируйте планшет в течение трех часов, чтобы клетки могли осесть в каркасах через три часа. Добавьте по 3,5 миллилитра РММ в каждую лунку, стараясь не выбить клетки из каркасов.

Выдерживайте тарелку в течение семи или 21 дня. Замените среду RMM через один день, который является первым кормлением, и снова замените среду через два-три дня после первого кормления. Через 7 и 21 день после 3D-культуры H nscs.

Удалите среду RMM и зафиксируйте дифференцированные клетки 4%-ным параформным альдегидом. Затем неподвижные клетки окрашивают с помощью первичного антитела бета-3 тубулина, обнаруженного с конъюгированным флуорохромом. Ядра клеток вторичных антител уравновешиваются крючками.

Сделайте репрезентативные изображения клеток, окрашенных бета-тремя тубулинами. С помощью флуоресцентного микроскопа сохраните изображения в формате TIFF или JPEG. Измерение роста аксонного отростка осуществляется с помощью программного измерительного прибора image PRO plus seven.

Чтобы начать открыть изображение, выберите параметр измерения на панели инструментов и выберите функцию трассировки. Чтобы начать трассировку, выберите начальную точку на выступе аксона, щелкнув кнопкой мыши по всей длине выступа аксона правой кнопкой мыши, чтобы завершить каждую трассировку. Таким образом, измерьте все выступы аксонов в поле зрения, выразите измерения в пикселях или микрометрах.

Экспорт измерений длины в программу электронных таблиц для сравнительного и статистического анализа образцов для оценки изменений в экспрессии микроРНК трехмерно культивируемых ГСК. Сначала проведите экстракцию микроРНК и получение микроРНК CD NA, как описано в прилагаемом протоколе. Текст сразу после получения микро РНК CD NA.

Приготовьте смесь компонентов ПЦР для ПЦР в реальном времени в пробирке объемом 15 миллилитров. Добавьте 1375 микролитров двух зеленых мастер-миксов X-S-Y-B-R. 100 микролитров микро РНК CD NA, 275 микролитров универсального праймера и 1000 микролитров РНК свободного водопереноса.

Компоненты ПЦР смешиваются с резервуаром для загрузки ПЦР. Осторожно извлеките 96-луночный планшет для ПЦР из герметичного пакета. С помощью многоканального дозеттера добавьте 25 микролитров компонентов ПЦР.

Перемешайте с каждой лункой ПЦР-матрицы. Меняйте наконечники пипеток после каждого этапа пипетирования, чтобы избежать перекрестного загрязнения между уплотнениями лунок. Планшет на 96 лунок с оптической клейкой пленкой и центрифугировать в течение одной минуты при 1000 GS при комнатной температуре для удаления пузырьков, визуально осмотреть планшет на предмет отсутствия пузырьков в месте лунок.

Матрица ПЦР на 96 лунок в программе циклера в реальном времени. Соответственно, велосипедист в реальном времени. Впоследствии экспортируйте значения КТ для всех скважин в пустую таблицу Excel для анализа данных ПЦР-массива, алгоритм, который доступен в режиме онлайн PIC ktar, используется для идентификации прогнозируемых мишеней микроРНК.

Нажмите здесь, нажмите здесь, чтобы увидеть прогноз на позвоночных, чтобы открыть новую страницу в веб-интерфейсе PIC KTAR. Выберите вид в выпадающем меню и вставьте интересующую микроРНК в поле идентификатора микроРНК. Нажмите кнопку «Поиск мишеней микроРНК».

Будет представлен список целевых мРНК, ранжированных по шкале PIC KTAR. Полученные рейтинги затем используются для составления сравнительной таблицы микроРНК. Двойная репортерная люциферазная плазмида используется в качестве инструмента для валидации целевых мРНК: активность светлячка и люциферазы почек измеряется через 24 часа после трансфекции клеток Hela.

Приготовьте рабочий раствор один, добавив 50 микролитров субстрата, один на 10 миллилитров раствора один и, перемешав, тщательно удалите клеточную питательную среду из каждой лунки 24-луночного планшета и добавьте по 300 микролитров рабочего раствора по одному в каждую. Хорошо переложите по 100 микролитров содержимого каждой лунки. Из 24-луночного планшета в три лунки 96-луночного планшета подождите 10 минут, а затем измерьте активность люциферазы светлячка в люминометре, настроенном для получения люминесценции.

Приготовьте рабочий раствор два, добавив 50 микролитров субстрата, от двух до 10 миллилитров раствора два и тщательно перемешайте. Добавьте по 100 микролитров рабочего раствора по два в каждую лунку из 96 луночных планшетов, уже содержащих 100 микролитров рабочего раствора. Подождите 10 минут, а затем измерьте активность почечной эльлюциферазы.

Впоследствии рассчитывается соотношение люминесценции от люциферазы светлячка к люциферазе почек. Репрезентативные микрофотографии H NSCS на 3D-скаффолдах были получены после иммунохимического окрашивания бета-3 тубулина, показанного зеленым цветом, и окрашивания счетчиком ядер с крючками, показанными синим цветом, измерения аксонных процессов было выполнено с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Сравнение роста аксонных отростков между H. nsc, выращенными с помощью 3D-скаффолдов, и с традиционными плоскими поверхностями или 2D-культурами показывает, что через одну или три недели 3D-дифференцированные ГСК продемонстрировали больший рост аксонного отростка.

Вычислительный анализ для прогнозирования мишени привел к представленной здесь информации: списку микроРНК, предсказанных генов-мишеней, а также оценке точности и агрегированным значениям. SOX 5 и NR 4 A 3 были идентифицированы как предполагаемые гены-мишени. Для валидации мишеней микроРНК был использован двойной репортерный анализ люциферазы, как показано здесь.

Относительная активность люциферазы от трех основных репортеров UTR человека к генам SOX 5 и NR 4 A 3 была значительно снижена в присутствии указанных микроРНК. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как дифференцировать его в нейральных стволовых клетках и исследовать экспрессию микроРНК и валидацию мишени Messenger.RNA.