Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Общая цель следующего эксперимента заключается в количественной оценке быстрых изменений адгезии клеток к матриксу в эндотелиальных клетках, подвергнутых воздействию агентов, модифицирующих матрикс, в режиме реального времени с использованием импеданса клеточного субстрата и прижизненной визуализации клеток. В данном экспериеме в качестве патофизиологически значимого агента, модифицирующего матрикс, используется гем-содержащий фермент миелопероксидаза. Это достигается путем предварительного покрытия поверхностей фибронектином для создания адгезивного матриксного субстрата.

Затем миелопероксидазе (MPO) дают связаться с фибронектином. Далее суспендированные эндотелиальные клетки высевают на поверхности и инкубируют для достижения максимальной адгезии и распластывания клеток на фибронектине. После этого клетки подвергают воздействию перекиси водорода для инициации окисления фибронектина, опосредованного MPO.

Последующие быстрые изменения адгезии клеток к матриксу количественно определяют в режиме реального времени с помощью измерения импеданса между клетками и субстратом, а также анализа прижизненной визуализации клеток. Результаты показывают, что быстрая потеря адгезии эндотелиальных клеток к матриксу, вызванная окислением фибронектина под действием NPO, может быть количественно определена в режиме реального времени с высоким временным разрешением и без использования меток с помощью измерения импеданса между клетками и субстратом и прижизненной визуализации. Преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют непрерывно количественно оценивать изменения адгезии клеток к матриксу с высоким временным разрешением, а это означает, что они могут дать важные новые сведения о том, как модификации матрикса определяют последующие изменения морфологии клеток и зависимые от адгезии сигнальные процессы.

Данные протоколы имеют более широкое значение, так как их можно легко адаптировать, заменив MPO другими агентами, модифицирующими матрикс, такими как матриксные гейтинги или протеазы, либо используя другие типы адгезивных клеток, помимо эндотелиальных, например, эпителиальные клетки. Для начала добавьте по 80 µL фибронектина в каждую лунку золотых микроэлектродных матриц с 96 лунками для измерения импеданса клеточного субстрата или добавьте 2 mL фибронектина в культуральные чашки со стеклянным дном для анализа визуализации живых клеток. Инкубируйте матрицы и/или культуральные чашки при 37 °C в течение двух часов.

Затем для блокировки поверхностей добавьте 0,2% BSA и инкубируйте при 37 °C в течение еще двух часов. Далее добавьте очищенную миелопероксидазу человека в HBSS и инкубируйте в течение 30 минут. Затем дважды промойте поверхности раствором HBSS, чтобы удалить несвязавшуюся MPO.

Затем высейте суспензию эндотелиальных клеток в концентрации 250 000 клеток на мл, подготовленную согласно текстовому протоколу, на 96-луночные микроэлектродные матрицы для измерения импеданса клеточного субстрата с поверхностями, покрытыми нативным фибронектином или фибронектином, модифицированным MPO. В чашки для культивирования клеток с стеклянным дном диаметром 35 мм добавьте по 2 мл суспензии с концентрацией 500 000 клеток на мл. Сразу после высева клеток установите планшеты с микроэлектродными матрицами в порт инкубатора для измерения импеданса клеточного субстрата при 37 °C и 5% carbon dioxide.

Снимите показания холостой пробы, чтобы начать непрерывный сбор данных об индексе клеток. Перенесите чашки для культивирования клеток с стеклянным дном диаметром 35 мм в инкубатор при 35 °C и 5% carbon dioxide. Инкубируйте в течение двух часов для обеспечения максимальной адгезии и распластывания клеток.

После инкубации приостановите считывание индекса клеток и ненадолго извлеките планшет с микроэлектродной матрицей или чашку с стеклянным дном из инкубатора, аспирируйте среду и добавьте подогретый HBSS для изучения эффектов ингибиторов, модуляторов MPO, катализируемых реакций или ингибиторов клеточной сигнализации. Добавьте их в культуры. После этого немедленно поместите планшет с матрицей обратно в порт инкубатора или чашку с стеклянным дном в инкубатор и дайте клеткам уравновеситься в течение 30 минут.

Для инициации катализируемого NPO окисления фибронектина под действием хлорноватистой кислоты и последующей деадгезии для исследования импеданса клеток извлеките планшет с микроэлектродной матрицей из инкубатора и приостановите измерения индекса клеток. Добавьте перекись водорода в HBSS и аккуратно перемешайте путем повторного пипетирования; немедленно установите микроэлектродную матрицу обратно в порт инкубатора и возобновите считывание индекса клеток. Для исследований живых клеток с использованием визуализации в стеклянных чашках с плоским дном диаметром 35 мм извлеките чашку из инкубатора и установите ее на подогреваемый до 37 °C предметный столик инвертированного конфокального микроскопа, оснащенного водным объективом 63x.

И оптика DIC. Для записи видео живых клеток сфокусируйтесь на клетках и оптимизируйте настройки оптики DIC в соответствии с приведенными здесь рекомендациями. Запустите запись видео в режиме DIC и регистрируйте базовые показатели необработанных клеток в течение одной минуты, затем добавьте перекись водорода и аккуратно перемешайте путем повторного пипетирования, снова настройте фокус микроскопа и продолжайте запись видео в режиме DIC для обработанных клеток в течение необходимого периода времени. Чтобы проанализировать данные об импедансе субстрата клеток, начните с экспорта данных в электронную таблицу для анализа адгезии клеток.

Для анализа данных визуализации живых клеток значения, зафиксированные непосредственно перед началом окисления фибронектина под действием MPO, принимают за единицу, представляя данные в виде графиков нормализованного индекса клеток в зависимости от времени. Откройте в программе для анализа изображений, такой как Image J, видеозаписи DIC-визуализации живых клеток, сделанные непосредственно до и после начала окисления фибронектина под действием MPO; в как минимум двух отдельных DIC-видео случайно выберите несколько клеток и измерьте их проекционную площадь в последовательных кадрах, вручную обводя край мембраны и подсчитывая количество заключенных внутри пикселей. В завершение представьте данные в виде графика зависимости нормализованной площади клеток от времени. Посев суспензий эндотелиальных клеток на фибронектин или фибронектин, подвергнутый воздействию MPO, приводит к максимальной адгезии и распластыванию клеток в течение двух часов, о чем свидетельствует выход значений индекса клеток на плато при взаимодействии клеток с субстратом.

Измерения импеданса после установления максимальной адгезии клеток на нативном фибронектине или фибронектине с MPO показывают, что направленное окисление фибронектина, опосредованное катализируемой MPO хлорноватистой кислотой и инициированное добавлением перекиси водорода в качестве косубстрата MPO, вызывает быстрое уменьшение площади контакта клеток с матриксом. Это фиксируется путем измерения импеданса клеточного субстрата и с помощью визуализации живых клеток; как показано здесь, быстрая деадгезия клеток, наблюдаемая в эндотелиальных клетках, связанных с фибронектином с MPO, в ответ на обработку перекисью водорода, отсутствует в клетках, обработаннных только перекисью водорода. Ингибирование моторной функции миозина II с помощью блебестатина снижает скорость деадгезии эндотелиальных клеток, что подтверждается измерением импеданса клеточного субстрата и визуализацией живых клеток, указывая на то, что клеточная деадгезия и сокращение в ответ на катализируемое MPO субклеточное окисление матрикса обусловлены силами натяжения актомиозина. Поскольку данные методы позволяют точно измерять очень быстрые изменения адгезии клеток, они могут дать критическое понимание причинно-следственных связей между изменениями адгезии и последующими изменениями в адгезионно-зависимых сигнальных процессах, таких как фосфорилирование SARK или сигнализация фокальных адгезий, которые можно легко измерить в параллельных экспериментах во времени с помощью вестерн-блоттинга.