Определение на основе экономического роста и биохимическая Подтверждение генетическим требованиям белка деградации в Saccharomyces Cerevisiae

Общая цель данного эксперимента заключается в быстром определении генетических потребностей для деградации нестабильного белка в Croce Visier. Это достигается путем слияния репортерного фермента, необходимого для роста в определенных условиях отбора, с нестабильным белком, представляющим интерес. Затем дикий тип или мутантные клетки, экспрессирующие гибридный белок, культивируются на селективных агаровых пластинах среды.

Анализ гальванических клеток обеспечивает удобный индикатор стабилизации белка на основе роста дрожжевых клеток с целью биохимически подтвержденных различий в распространенности белка, в то время как тип мутантных клеток, содержащих гибридный белок, лизируется с помощью быстрого неэффективного метода экстракции белка для вестерн-блоттинга. Результаты показывают, что обилие нестабильного белка увеличивается в клетках с мутацией в гене, необходимом для деградации. Обратное справедливо для деградации компетентных сортов дикого типа.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как анализ по шкале пульса и анализ по циклической шкале Хейде, заключается в том, что он менее трудоемкий и занимает много времени, что позволяет быстро и с высокой пропускной способностью определять генетические потребности для деградации белка. Тем не менее, этот метод может дать представление о потребностях в деградации для ряда нестабильных белков. Он также может быть использован для идентификации регуляторов других аспектов экспрессии генов, таких как транскрипция и трансляция.

Демонстрировать процедуры будут Шелдон Уоттс и Джастин Краудер. Студенты в моей лаборатории: Перед анализом преобразуют плазмиду, кодирующую гибридный белок, состоящий из нестабильного белка и метаболического репортерного фермента, в мутантный штамм дрожжей. Подозреваемые в наличии генетических дефектов, относящихся к регуляции деградации белка в качестве контроля, также трансформируют ту же плазмиду в штамм дрожжей дикого типа.

Инокулируйте трансформанты в пять миллилитров минимальной среды, которая отбирает клетки, содержащие молекулы плазмиды. Поместите пробирку в наклонный вращатель и инкубируйте в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия на следующий день. Измерьте оптическую плотность ночных культур, затем уравняйте концентрацию клеток для всех клеток, разбавив каждую культуру до наружного диаметра 600 0,2 свежей средой и стерильными отдельными центрифужными пробирками объемом 1,5 миллилитров.

Чтобы начать основной анализ, настройте матрицу шестикратного разведения, сначала передав по 200 микролитров каждого предварительно разведенного штамма, начиная с наружного диаметра 600 0,2 в предназначенные лунки в первой колонке стерильной 96-луночной пластины при подготовке к последующим разведениям, с помощью многоканальной пипетки добавьте 125 микролитров стерильной воды в пустые лунки во второй колонке, три, и четыре. Затем перенесите 25 микролитров дрожжей из первой колонки во вторую, несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы равномерно перемешать клетки, и приступайте к переносу 25 микролитров клеток из второй колонки в третью. Повторяйте последовательные этапы разведения до тех пор, пока лунки в четвертой колонне не будут хорошо перемешаны в качестве визуального пособия для обнаружения клеток.

Распечатайте шаблон сетки и прикрепите его скотчем к внутренней стороне крышки чашки Петри, начиная с наименее концентрированного столбца в матрице серийного разбавления. Перелейте по четыре микролитра клеток из каждой колонки. На 96-луночной пластине на контрольную минимальную среднюю агаровую пластину, которая отбирает для внутриклеточного поддержания плазмиды Поместите еще четыре микролитра клеток из каждой колонки на отдельную минимальную среднюю агаровую пластину, которая отбирает обе внутриклеточные плазмиды.

Поддержание и экспрессия нестабильного гибридного белка. Дайте обеим пластинам высохнуть на скамейке в течение пяти-10 минут. Закройте крышки парамом, чтобы предотвратить обезвоживание, и инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-шести дней.

Когда колонии самой быстрорастущей культуры впервые становятся заметными в самом разбавленном месте на данной пластине, извлеките пластину из инкубатора и задокументируйте степень роста. При фотографировании может возникнуть необходимость сфотографировать разные тарелки в разные дни или одну и ту же тарелку в течение нескольких дней. В случае различных штаммов дрожжей, которые демонстрируют широкий диапазон скоростей роста, биохимически подтверждено, что ген, идентифицированный в анализе роста, регулирует содержание белка, начните с трансформации дикого типа и мутантных штаммов дрожжей с плазмидой, кодирующей вышеупомянутый гибридный белок, инокулируйте трансформанты в пять миллилитров минимальной среды, которая отбирает для внутриклеточного поддержания плазмиды и инкубируйте пробирки в течение ночи в ротаторе с наклоном 30 градусов Цельсия.

На следующий день измерьте оптическую плотность на уровне 600 каждой ночной культуры. Как только все штаммы достигнут OD 600 0,4 или выше, разбавьте все культуры до 0,2 свежей средой таким образом, чтобы конечный объем для каждого штамма составил 10 миллилитров. Инкубируйте клетки в вибростенде с температурой 30 градусов Цельсия до тех пор, пока все культуры не достигнут OD 600 в середине логарифмической фазы роста от 0,8 до 1,2.

Соберите клетку, перенеся 2,5 единицы наружного диаметра клеток в свежую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте клетки при комнатной температуре в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость S. Затем добавьте один миллилитр дистиллированной воды вихрем или пипеткой вверх и вниз, чтобы восстановить небо, и перенесите клеточную суспензию в свежую 1,5-миллилитровую пробирку.

Изолируйте клетки с помощью второго центрифугирования в течение 30 секунд При комнатной температуре удалите нац и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах дистиллированной воды. Добавьте 100 микролитров 0,2 молярного гидроксида натрия в клеточную суспензию, пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы перемешать и инкубировать образцы в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы избежать преждевременного клеточного лизиса. Не делайте вихри на клетках.

Снова изолируйте клетки с помощью третьего центрифугирования в течение 30 секунд. При комнатной температуре удалите надосадочную жидкость из клеток и лизуйте клетки с помощью ресуспензии в грануле от 50 до 100 микролитров одного х ламби образца буфера, денатурируйте все белки путем инкубации суспензии при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите весь лизат клеток на льду в течение пяти минут. Для определения обилия белков, склонных к агрегации, таких как белки с несколькими трансмембранными сегментами, эмпирически определяют оптимальную денатурирующую инкубацию, температуру и время, начиная с 70 градусов Цельсия в течение 10 минут вместо 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Наконец, изолируйте растворимую фракцию, центрифугируя лизат в течение одной минуты при комнатной температуре, переложите раствор в свежую пробирку и выбросьте нерастворимую фракцию гранул. Растворимая фракция теперь может быть загружена непосредственно на страницу SDS, геле или храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия при настройке анализа деградации белка на основе роста дрожжей. Нестабильный белок тройного слияния сливается с дополнительным метаболическим ферментом, который дополняет фон штамма дрожжей, лишенного того же метаболического гена.

Когда гибридный белок экспрессируется в дрожжах, он подвержен бесплодным транслокационным событиям на мембране эндоплазматического ретикулума. Эта аберрантная транслокация запускает опосредованную убиквитином деградацию всего белка, включая метаболический фермент, тем самым предотвращая пролиферацию клеток. Однако в штаммах дрожжей, лишенных убиквитинлигазы, гибридный белок защищен от деградации, даже при средней транслокации, что позволяет клеткам размножаться.

Таким образом, в присутствии убиквитинлигазы существует соответствие между деградацией белка, происходящей внутри клеток, и неспособностью дрожжевых клеток пролиферировать на обедненных метаболитами агаровых пластинах. С другой стороны, в контексте дефектного или отсутствующего убиквитин-лигазы пролиферация клеток указывает на то, что гибридный белок был защищен от деградации с целью уменьшения фонового или ложного роста и повышения строгости этого анализа. Конкурентные ингибиторы метаболического фермента могут быть добавлены в питательную среду для подтверждения результатов, наблюдаемых в анализе роста дрожжей.

Прямое доказательство деградации слитого белка также может быть установлено с помощью вестерн-блоттинга. В присутствии или отсутствии убиквитинлигазы гибридный белок будет деградирован или сохранен от разрушения соответственно. Важно помнить, что эти процедуры наиболее непосредственно указывают на равновесное содержание интересующего белка.

После проведения этих процедур можно провести анализ пульса или циклогексимида для непосредственного анализа кинетики деградации белка и наличия мутаций, которые, как было обнаружено, увеличивают уровни белка в исследуемом состоянии.