Количественный масс-спектрометрический Профилирование раковых клеток протеомов, полученные из жидких и твердых опухолей

Общая цель этой процедуры заключается в выяснении профилей экспрессии белков жидких и солидных опухолей. Это достигается путем обогащения раковых клеток из образцов крови или тканей, полученных от пациента. На втором этапе белки выделяют из раковых клеток, а затем смешивают со стандартом количественного определения susac, специфичным для опухоли.

На заключительном этапе белковая смесь переваривается. В конечном счете, масс-спектрометрия используется для отображения профилей экспрессии белков из жидких и солидных опухолей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области онкологии и патологии, например, как можно определить мишени для лекарств и механизмы резистентности к терапии?

Хотя этот метод может дать представление о поиске биомаркеров, он также может быть применен к другим системам, таким как исследование разнообразных, твердых и жидких раковых опухолей. Чтобы подготовить жидкие опухолевые клетки для флуоресцентной сортировки с помощью проточной цитометрии, начните с того, что Али цитирует один миллилитр образца мононуклеарной клетки человека, суспендированного в PBS плюс 2% FBS для отрицательного контроля, и один миллилитр для каждого флуоресцентного красителя, используемого в окончательном окрашивании. Затем инкубируйте клетки с соответствующими антителами для выделения популяции лейкозных клеток и для компенсационного контроля на льду.

Через 30 минут дважды промойте клетки PBS плюс 2%FCS. Затем добавьте в соответствующие пробирки краситель для определения жизнеспособности клеток и отсортируйте клетки по схеме. Сбор образцов в IMDM плюс 10% FCS для сбора солидных опухолей методом микродиссекции с лазерным захватом.

Во-первых, с помощью микротома вырежьте срезы толщиной от пяти до 10 микрометров из образцов, залитых формином фиксированным парафином. Затем закрепите секции на пленочных пленочных предметных стеклах и высушите образцы при температуре 37 градусов Цельсия через час. Депарируйте и регидратируйте секции путем последовательной одноминутной инкубации в абсолютном этаноле ксилола, 70% этаноле и воде.

Затем окрашивайте срезы гематином в течение 20 секунд. Промойте их водой из-под крана и соберите интересующие клетки с помощью системы микродиссекции лазерного захвата, чтобы извлечь белок из отсортированных жидких опухолевых клеток. Открутите образец три раза, промыв клетки в 500 микролитрах холодной PBS во время вторых двух центрифугирований.

Затем инкубируйте клетки в 40 микролитрах буфера для лизиса из расчета от 10 до шести клеток. Через 15 минут центрифугируйте лизат и перенесите прозрачный лизат, содержащий надосадочную жидкость, в новую реакционную пробирку для извлечения белка из микрорассеченных клеток солидных опухолей. Инкубируйте образец ткани с 60 микролитрами буфера для лизиса тканей при температуре 72 градуса Цельсия.

Через 15 минут соберите жидкость путем короткого центрифугирования и перенесите надосадочную жидкость в новую реакционную пробирку. Затем ультразвуком обрабатывайте лизат на льду в течение трех минут, после чего следует инкубация с 15 микролитрами, которые содержат 20% сульфата натрия ESAL при температуре 99 градусов Цельсия в нагревательном блоке с перемешиванием 600 об/мин. Через час уменьшите лизат и перенесите S-натин в новую пробирку.

Затем определите концентрацию белка очищенной клетки и стандарта super SLAC, а затем смешайте равное количество кусочков опухолевых клеток со стандартом super SLAC, а затем с литием. Вносите обесцезивной сульфатный буфер в дозе 25% от объема образца и восстановитель в дозе 10% от объема образца. Затем нагрейте полученный раствор в нагревательном блоке в течение 10 минут при температуре 72 градуса Цельсия.

Для измерения концентрации белка лизата солидной опухоли на планшете смешайте стандартный ряд растворов для разведения бычьего сывороточного альбумина, лизат и соответствующий стандарт super SLAC с коммерчески доступным белковым анализом и 96-луночным планшетом. После одной минуты встряхивания инкубируйте образец в течение соответствующего периода времени и измерьте поглощение в соответствии с указаниями производителя. Затем смешайте равное количество осветленного лизата и стандарта super SLAC с 200 микролитрами мочевины в фильтрующем блоке и центрифугируйте образцы в течение 30 минут.

Анализировать лизаты опухолевых клеток методами жидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа. Начните с разложения интересующих пептидов в 30 микролитрах загрузочного буфера в течение пяти минут в ультразвуковой ванне. Затем уменьшите содержание белка и перенесите прозрачную надосадочную жидкость в пробирку с масс-спектрометрическим автопробником.

Затем введите пять микролитров образца для анализа в нано-жм, систему MS autos, пробоотборник, а также сконцентрируйте и обессолите пептиды в режиме обратной фазы C 18, установленной и вентилируемой колонкой. Наконец, разделите пептиды на микроколонке обратной фазы C 18 в самодвижущейся нанораспылительной колонне. Используя 90-минутный градиент от 5 до 35% ацетилнитрила против 0,1% водной муравьиной кислоты при 300 нанолитрах в минуту, затем используйте источник ионов с нанораспылением для переноса и анализа пептидов.

Используя метод сбора данных, основанный на 15 основных данных, для анализа пептидов можно использовать различные типы масс-спектрометров. Протеомное профилирование жидких и солидных опухолей пациентов является перспективным подходом к открытию новых диагностических и прогностических биомаркеров. Например, этот первый рисунок демонстрирует образцовую стратегию гейтирования для выделения CD 17 красителей, лейкозных клеток из жидкого образца опухоли.

В то время как здесь секция толщиной от пяти до 10 микрометров, установленная на пленочной пленке, скользит, как только что продемонстрировано. Как показано, область интереса была затем выбрана вручную и вырезана с помощью микродиссекции лазерного захвата, затем может быть выполнен неконтролируемый кластерный анализ профилей экспрессии белков жидких и солидных образцов опухолей с помощью масс-спектрометрии, что позволяет четко разделить различные опухолевые образования в соответствии с их различными профилями экспрессии белков. Эти данные могут в конечном итоге способствовать установлению клинически значимых биомаркеров.

Реализация стратегий обогащения для посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование или вентиляция UIC, также может быть выполнена для ответа на дополнительные вопросы, такие как: как можно идентифицировать паттерны нерегулируемой киназы после ее развития? Этот метод открывает путь для исследователей в области патологии и онкологии к изучению специфических биомаркеров и сигнальных путей в различных раковых заболеваниях. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять белки из раковых опухолей в качестве субпопуляций для анализа их паттернов экспрессии белков и сигнальных состояний с помощью масс-спектрометрии.