Самоорганизация сложных двумерных фигур из одноцепочечной ДНК Плитка

Общая цель следующего эксперимента заключается в формировании сложных ДНК-наноструктур с использованием одноцепочечных плиток. Это достигается путем смешивания тщательно разработанных синтетических цепей ДНК в соответствующем буферном растворе для формирования требуемой ДНК-наноструктуры на втором этапе. Затем образец подвергается отжигу, в ходе которого происходит самосборка структуры.

Затем проводят гель-электрофорез в нативных условиях и визуализацию с помощью атомно-силового микроскопа, чтобы подтвердить успешное формирование наноструктур. Результаты гель-электрофореза в нативных условиях и атомно-силовой микроскопии показывают, что ДНК-наноструктуры собрались самостоятельно. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как подготовка образцов для такой самосборки представляется сложной. Перед началом данной процедуры полученные от производителя олигонуклеотидов одноцепочечные фрагменты ДНК заданной последовательности растворяют в воде, свободной от РНКаз, в 96-луночных планшетах Vbo; затем с помощью пипетки переносят 1 µL из каждой из 362 лунок для 24 спиралей и 28 поворотов.

Добавьте 100 micromolar каждой цепи в пробирку объемом два миллилитра. Затем добавьте в пробирку 138 microliters дистиллированной деионизированной воды для приготовления основного раствора с концентрацией 200 nanomolar каждой цепи.

Добавьте 50 µL стокового раствора с концентрацией 200 нМ, 10 µL 10-кратного буфера для отжига A и 40 µL дистиллированной деионизированной воды в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл. После этого проведите отжиг образца в течение 17 часов в термоциклере при охлаждении с 90 до 25 °C.

После приготовления нативного 2% агарозного геля, предварительно окрашенного красителем SYBR safe, проведите электрофорез в течение двух часов при 100 вольтах в ледяной водяной бане. По завершении визуализируйте гель с помощью гель-сканера с соответствующим фильтром для красителя SYBR safe на синем трансиллюминаторе; вырежьте острым чистым лезвием доминирующую полосу, подвижность которой схожа с полосой 1,500 base pairs маркера ДНК one Kilobase. Поместите выбранные фрагменты геля в спин-колонку, затем измельчите гель на мелкие кусочки с помощью микропести})$, после чего центрифугируйте при 438 G в течение трех минут при температуре четыре градуса Celsius.

После центрифугирования измерьте концентрацию ДНК с помощью ультрафиолетового спектрофотометра при 260 нанометрах. На этом этапе снимите слюду, прикрепленную к металлическому диску с образцом, с помощью клейкой ленты, чтобы получить плоскую поверхность, и поместите диск с образцом на предметный столик микроскопа.

Добавьте 40 µL одного x и коленного буфера A, а затем 5 µL очищенного образца из 24 HELOCs по 28 оборотов прямоугольника на свежеочищенную поверхность Micah. Дайте смеси осесть в течение примерно двух минут. Установите чип с кантилевером из нитрида кремния A FM в держатель кантилевера и получите изображение образца в режиме жидкостного постукивания, используя размер сканирования 2 µm и разрешение 1024 линии.

И скорость сканирования от 0.5 до 1 Гц для внутренней маркировки, прикрепленной к 3'-концу 17-нуклеотидного сегмента к восьми внутренним плиткам и шести граничным плиткам прямоугольника. Смешайте 28 цепей с хендлами с остальными компонентными цепями 24 HELOCs прямоугольника из 28 поворотов, чтобы приготовить стоковый раствор с концентрацией 200 nM для маркировки границ. Смешайте 14 цепей с хендлами с остальными компонентными цепями 24 HELOCs прямоугольника из 28 поворотов, чтобы получить стоковый раствор с концентрацией 200 nM для внутренней маркировки.

Для маркировки границы добавьте в ПЦР-пробирку 50 µL стокового раствора 200 нМ, 60 µL биотинилированных анти-хендл-цепей в концентрации 100 мкМ, 10 µL 10-кратного отжигающего буфера А и 34 µL дистиллированной деионизированной воды.

Для внутреннего маркирования в ПЦР-пробирку добавьте 50 µL стокового раствора с концентрацией 200 nM, 3 µL внутренний модифицированный биотином анти-хендл-остов с концентрацией 100 µM, 10 µL 10-кратного буфера для отжига A и 37 µL дистиллированной деионизированной воды.

Затем отвесьте 0,06 г формиата урины в 3 мл дистиллированной воды. Для приготовления 2% водного окрашивающего раствора формиата урины профильтруйте его через фильтр с порами 0,2 мкл, закрепленный на шприце. Добавьте 5 мкл 5 н. гидроксида натрия к 1 мл профильтрованного окрашивающего раствора.

После короткого перемешивания раствора на вортексе центрифугируйте его при 20 000 G. Обработайте углеродные сетки 글로у-разрядом (glow discharge), расположив их покрытой стороной вверх, используя следующие настройки. По завершении нанесите пипеткой 3,5 µl образца на сетку, прошедшую 글로у-разряд. Через четыре минуты удалите излишки образца с помощью кусочка фильтровальной бумаги, прижав её к краю сетки.

Сразу после этого нанесите на сетку 3,5 µl раствора красителя. Через одну минуту удалите излишки красителя с помощью фильтровальной бумаги, прижимая её к сетке в течение одной-двух минут. Перенесите сетку в держатель для образцов ПЭМ.

Изображение получено с помощью A-J-E-O-L GM 1400 при ускоряющем напряжении 80 kilovolts и увеличении от 10 K до 80 K. После определения формы выберите на молекулярном холсте цепи, соответствующие этой форме. Замените открытый домен сегментом poly T длиной от 10 до 11 нуклеотидов или добавьте протектор края, комплементарный открытому домену, и завершите его сегментом poly T длиной от 10 до 11 нуклеотидов. Чтобы предотвратить агрегацию, создайте библиотеку цепей для молекулярного холста размером 310 pixel, включая корсет.

Подготовьте набор one star, набор two star, набор three star и набор four star, чтобы в общей сложности получилось 1 344 защитных элементов краев. После центрифугирования 96-луночных планшетов для различных наборов перенесите пипеткой 1 µL 206 цепей из основного набора (core set), 0 из набора one star, 0 из набора two star, 0 из набора three star и 24 цепи из набора four star в центрифужную пробирку объемом 2 mL. Добавьте в пробирку 20 µL дистиллированной деионизированной воды, чтобы получить стоковый раствор цепей ДНК с концентрацией 400 nM.

Затем добавьте 50 µL стокового раствора с концентрацией 400 nM, 10 µL 10-кратного отжигающего буфера B и 40 µL дистиллированной деионизированной воды в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл и проведите отжиг смеси в термоциклере в течение 17 часов, как было описано ранее. После очистки образца и измерения концентрации ДНК визуализируйте образец с помощью FM аналогичным образом, чтобы в итоге сконструировать прямоугольники разных размеров, просто изменяя количество параллельных спиралей и количество витков спирали.

Самосборка одноцепочечных плиток приведет к образованию прямоугольника размером 24 HELOCs на 28 поворотов; последовательности ДНК для различных одноцепочечных плиток могут быть модифицированы и оптимизированы для обеспечения разделения и маркировки стрептавидином, что позволяет трансформировать прямоугольник в трубку. Программируемая самосборка одноцепочечных плиток с формированием трубок и прямоугольников различных размеров, а также создание произвольных двумерных фигур с использованием молекулярного холста, были протестированы. В качестве решений проблемы агрегации вдоль открытых доменов произвольных фигур были проверены дизайн с заменой домена и дизайн с защитником края. Оба варианта дизайна обладают сопоставимым выходом геля и структурной целостностью, однако дизайн с защитником края является более экономически эффективным, так как требует меньшего количества вспомогательных компонентов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать сложные ДНК-наноструктуры на основе одноцепочечных плиток.