Самоорганизация сложных двумерных фигур из одноцепочечной ДНК Плитка

Общая цель данного эксперимента — формирование сложных наноструктур ДНК с одноцепочечными плитками. Это достигается путем смешивания тщательно спроектированных синтетических нитей ДНК в желаемом буферном растворе для формирования желаемой наноструктуры ДНК в качестве второго этапа. Образец представляет собой колено, во время которого происходит самосборка конструкции.

Затем проводится нативный гель-электрофорез и атомно-силовой микроскоп для проверки успешного формирования наноструктур. Результаты показывают самоорганизующиеся наноструктуры ДНК на основе нативного агроса, гель-электрофореза и атомно-силового микроскопа. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что подготовка образцов такой самосборки представлялась сложной: перед началом этой процедуры были получены нити компонентов ДНК указанных последовательностей, растворенных в свободной воде РНК от производителя олигонуклеотидов в 96 луночных пластинах, пипетка по одному микролитру из каждой из 362 лунок для 24 спиралей по 28 витков.

Прямоугольник прибавляем 100 микромоляров на нить в двухмиллилитровую пробирку. Затем добавьте в пробирку 138 микролитров дистиллированной деионизированной воды, чтобы получился стоковый раствор. При концентрации 200 наномоляров на нить.

Добавьте 50 микролитров 200 молярного исходного раствора. 10 микролитров 10 x буфера для отжига А и 40 микролитров дистиллированной деионизированной воды в 0,2 миллилитровую ПЦР-пробирку. После этого образец в течение 17 часов помещают в термоамплификатор, охлаждающий от 90 до 25 градусов Цельсия.

После приготовления нативного геля 2%агрос, окрашенного в SYBR safe, запустите его в течение двух часов при напряжении 100 вольт на ледяной водяной бане. По окончании изображения геля с помощью гелевого сканера с соответствующим фильтром для безопасного окрашивания SYBR на синий свет транслюминатором иссекают доминантную полосу с аналогичной подвижностью полосе из 1,500 пар оснований одного килобазового ДНК лестницы с помощью острого чистого бритвенного лезвия. Поместите нужные кусочки геля в спин-колонку, а затем измельчите гель на мелкие кусочки с помощью микропробирки Пеле, затем центрифугируйте при 438 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

Последующее центрифугирование. Измерьте концентрацию ДНК с помощью ультрафиолетового спектрофотометра на 260 нанометрах. На этом этапе снимите слюду, прикрепленную к металлическому диску образца с помощью скотча, чтобы получить плоскую поверхность, и поместите диск для образца на визуализирующий столик микроскопа.

Добавьте 40 микролитров одного x и коленопреклоненного буфера A, а затем пять микролитров очищенного образца из 24 HELOCs на 28 оборотов прямоугольника на свежерасщепленную поверхность Micah. Дайте смеси отстояться примерно две минуты. Установите кантилеверный чип A FM из нитрита кремния на держатель кантилевера, визуализируйте образец в режиме отбора жидкости с помощью сканирования размером два микрометра 1024 линии для разрешения.

И скорость сканирования от 0,5 до одного герца для внутренней маркировки, прикрепленной к трем простым 17-нуклеотидным сегментам к восьми внутренним плиткам и шести граничным плиткам прямоугольника. Смешайте 28 нитей с ручками с остальными составляющими нитями прямоугольника 24 HELOC на 28 витков, чтобы получить стоковый раствор 200 NANOMOLAR для маркировки границ. Смешайте 14 прядей с ручками с остальными составляющими нитями прямоугольника 24 пятки моря на 28 оборотов, чтобы получить стоковый раствор 200 наномоляров для внутренней маркировки.

Для маркировки границ добавьте 50 микролитров 200 наномолярного стокового раствора. 60 микролитров 100 микромолярного биотина, модифицированных против ручки. 10 микролитров 10 буфера для отжига А и 34 микролитра дистиллированной деионизированной воды в пробирку для ПЦР.

Для внутренней маркировки добавьте 50 микролитров 200 наномолярного исходного раствора. Три микролитра внутренней антирукояточной нити биотина модифицированы на 100 микромолярах. 10 микролитров 10 х отжигающего буфера А и 37 микролитров дистиллированной деионизированной воды в ПЦР-пробирку.

Далее взвесьте 0,06 грамма крапового формиата в трех миллилитрах дистиллированной воды. Чтобы приготовить 2%-ный водный раствор для окрашивания мочевого гриба, отфильтруйте раствор с помощью фильтра объемом 0,2 микролитра, прикрепленного к шприцу. Добавьте пять микролитров из пяти нормальных гидроксидов натрия в один миллилитр отфильтрованного раствора для окрашивания.

После кратковременного завивки раствора центрифуга при температуре 20 000 G накаливается. Выгрузите решетки с углеродным покрытием стороной с покрытием вверх, используя следующие настройки: По завершении нанесите пипетку 3,5 микролитра образца на решетку, обработанную тлеющим разрядом. Через четыре минуты используйте лист фильтровальной бумаги, чтобы отвести образец, приблизив фильтровальную бумагу к сетке сбоку.

Вслед за этим сразу же добавьте в сетку 3,5 микролитра раствора для морилки. Через минуту смойте пятно и прижмите фильтровальную бумагу к сетке в течение одной-двух минут. Перенесите сетку в держатель образца ПЭМ.

Изображение с помощью A-J-E-O-L GM 1400, работающего при напряжении 80 киловольт с увеличением от 10 К до 80 К. После того, как форма была определена, выберите нити, соответствующие форме на молекулярном холсте. Замените открытый домен полиТ-сегментом длиной от 10 до 11 нуклеотидов или добавьте защитный герметик, который является комплементарным к открытому домену, и завершите его длинным полиТ-сегментом с 10-11 нуклеотидами. Чтобы предотвратить агрегацию, создайте библиотеку нитей для молекулярного холста размером 310 пикселей, в который входит корсет.

Установите одну звезду, набор двух звезд, три звезды и набор четырех звезд, чтобы получить в общей сложности 1 344 защиты кромок. После центрифугирования 96-луночных планшетов для различных наборов, пипетируйте один микролитр 206 нитей из набора ядер, ноль из набора, одну звезду ноль из набора, две звезды ноль из набора, три звезды и 24 нити из набора четыре звезды в двухмиллилитровую центрифужную пробирку. Добавьте в пробирку 20 микролитров дистиллированной деионизированной воды, чтобы получить 400 наномолярный стоковый раствор нитей ДНК.

Затем добавьте 50 микролитров 400 наномолярного исходного раствора. 10 микролитров 10 x отжигающего буфера B и 40 микролитров дистиллированной деионизированной воды в 0,2-миллилитровую ПЦР-пробирку и поместите смесь в термоамплификатор на 17 часов, как описано ранее. После очистки образца и измерения концентрации ДНК образец с помощью FM таким же образом, как и до четырех, окончательно строит прямоугольники разного размера, просто изменяя количество параллельных heoc и количество спиральных витков.

Самосборка одноцепочечных плиток даст 24 HELOCs на 28 витков, последовательности ДНК прямоугольника для различных одноцепочечных плиток могут быть изменены и оптимизированы, чтобы обеспечить стрептококковое деление и маркировку превращения прямоугольника в трубку. Программируемая самосборка одноцепочечных плиток для формирования трубок и прямоугольников различных размеров, а также построение двумерных произвольных форм с использованием молекулярного холста Domain Substitution design и edge protector design были протестированы в качестве решений для агрегации вдоль открытых областей произвольной формы. Обе конструкции имеют сопоставимый выход геля и структурную целостность, но конструкция с защитой краев более экономична, поскольку требует меньшего количества вспомогательных веществ.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать сложные наноструктуры ДНК на основе одноцепочечных плиток.