Трансфекцию, Селекция, и колонии-сбор человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Тален ориентированные с GFP гена в AAVS1 Safe Harbor

Общая цель этой процедуры заключается в создании изолята AA против одной безопасной гавани, целевых индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток или клонов IPSC, экспрессирующих GFP. Это достигается путем эффективной доставки донорских плазмид AAV one talon и a A VS one C-A-G-E-G-F-P в IPC путем поражения ядер. На втором этапе клетки-мишени A vs one отбираются с помощью пур-мицина на эмбриональных клетках мыши.

Затем отдельные GFP, экспрессирующие целевые клоны A A VS ONE, собираются в 96-луночный планшет с матригелевым покрытием. На заключительном этапе клоны A A VS ONE G-F-P-I-P-S-C расширяются с помощью E eight medium и стандартных методов культивирования IPSC. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия используются для демонстрации равномерной и устойчивой экспрессии GFP в клонах АА VS одного из целевых клонов IPSC человека.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы отбора колоний включают микропрепарирование целевых клонов с использованием специальных инструментов для сбора колоний под микроскопом, что трудно изучить во время параллельного обучения. Начните с промывки культур IPSC по одному разу PBS. Затем добавьте по одному миллилитру реагента для мягкой диссоциации клеток 37 градусов Цельсия в каждую лунку и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно пяти минут, когда более 50% клеток диссоциируют из питательного сосуда.

С помощью пипетки P 1000 механически разрушайте все оставшиеся скопления клеток или прикрепленные клетки. Затем добавьте по два миллилитра среды Е восемь в каждую лунку и с помощью пипетки объемом 10 мл дополнительно разложите культуры на одноклеточные суспензии. Теперь соберите собранные клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров и раскрутите их.

Повторно суспендируйте гранулу в минимальном количестве Е восемь в среде для подсчета. Затем, после подтверждения жизнеспособности культур путем трианового синего исключения, а также их достаточной диссоциации, переносят по 3 млн клеток в каждую из двух 15-миллилитровых конических пробирок, при этом клетки центрифугирования устанавливают систему электропорации на тип клетки, специфичную для эмбриональных стволовых клеток человека линии Н 9. Затем добавьте 10 мкг одного гомологичного рекомбинационного донора к одной грануле для контрольного образца и 10 мкг гомологичной рекомбинационной донорской плазмиды, а также по пять мкг каждой когтевой плазмиды для экспериментального образца.

Далее добавьте 100 микролитров полного раствора для трансфекции клеток комнатной температуры P трех первичных клеток в каждую из контрольных и экспериментальных гранул и повторно суспендируйте клетки. Переложите образцы в отдельные кюветы, а затем съешьте образцы сразу после трансфекции. Добавьте 500 микролитров E 8 среды комнатной температуры в каждую Q vet, а затем переложите трансфицированные образцы IPSC по каплям в отдельные 10-сантиметровые чашки, содержащие четыре эмбриональных фибробласта мыши DR. Перед отбором колоний совместите лунку 96-луночного планшета с 50 микролитрами раствора базальной мембраны, а затем храните планшет на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на следующее утро.

Когда планшет достигнет комнатной температуры, отсадите излишки раствора и загрузите в каждую лунку по 100 микролитров Е восьмой среды, дополненной 10 микромолярами Y 2 7 6 3 2. Затем поместите инвертированный микроскоп в шкаф биологической безопасности и простерилизуйте его легким распылителем с содержанием этанола 70%. Затем поместите стеклянную пастбищную пипетку над горелкой Бунзена, чтобы создать инструмент для сбора колоний с крошечным крючком на кончике после стерилизации 70% этанолом.

Поместите крючок в капюшон для просушки, а затем поместите культуру IPSE на предметный столик микроскопа, чтобы выбрать клоны. Найдите подходящую колонию при небольшом увеличении и используйте инструмент для ее обводки и четвертования с помощью инструмента для ее разрезания. Затем аккуратно соскребите четвертую колонию с питательного сосуда и с помощью пипетки P 200 объемом около 30 микролитров соберите свободно плавающие ИПК, покрывающие клетки непосредственно на матрице базальной мембраны.

По мере сбора урожая МПК должны прикрепляться в течение двух-четырех часов после нанесения покрытия. Наконец, инкубируйте выбранные колонии в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и обновите клетки полной средой E eight на следующее утро. Важно трансфекировать только высококачественные I PSC на протяжении всего эксперимента.

Культуры IPSC должны содержать в основном отдельные колонии, несущие булыжникообразную морфологию, поскольку видимые здесь клетки и дифференцированные клетки не должны составлять более 10% культуры, трансфективная способность IPC может быть оценена и оптимизирована с использованием небольшого вектора PAX GFP, поскольку трансфекция PAX GFP обычно представляет собой максимально достижимую эффективность из-за его небольшого размера. Транзиторная экспрессия A VS S ONE C-A-G-E-G-F-P интел и трансфицированных ИПК достигает пика через 48–72 часа после трансфекции, что может быть подтверждено с помощью небольшой части трансфицированных клеток с помощью проточной цитометрии. Эффективность трансфекции может сильно варьироваться.

Даже в экспериментах с GFP положительная доля составляет всего 10%.Отдельные клоны, демонстрирующие равномерную флуоресценцию, должны быть достаточно велики для сбора колонии после отбора чистого мицина. Кроме того, попав в 96-й формат, расширенные целевые клоны IPSC должны демонстрировать стабильное и единообразное выражение GFP. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как эффективно трансфицировать I PSC с помощью ядерного воздействия и как изолировать одну безопасную гавань AV.

Таргетированные клоны IPSE с использованием инструментов для сбора колоний.