В Ситу Ca 2+ изображений нервной системы кишечной

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации активности энтеральных нейронов и глии в живых цельных препаратах кишечника с использованием флуоресцентных индикаторных красителей кальция. Это достигается путем предварительного вырезания части кишечника животного и помещения его в предварительно подогретую среду. Второй шаг заключается в том, чтобы вскрыть кишечник вдоль брыжеечной границы и прижать его под легким напряжением поверхностью слизистой оболочки вверх.

Препараты миентерального сплетения готовятся методом микродиссекции и помещаются в чашки для визуализации. Далее вся монтировка препаратов загружается флуоресцентным индикатором красителя от гриппа в четыре раза в инкубатор. На заключительных этапах загруженные препараты визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой с высоким разрешением, управляемой программным обеспечением для сбора и анализа изображений для регистрации исходной активности.

Затем добавляются исследуемые препараты и регистрируются транзиенты кальция в нейронах и глии. В конечном счете, на месте. Визуализация кальция в энтеральной нервной системе используется для изучения того, как клеточная активность в нейронах и глии способствует регуляции физиологических функций кишечника и дисфункции энтеральной нервной системы в патофизиологии кишечника.

Применение этой техники простирается на установление понимания физиологии и патофизиологии функциональных расстройств кишечника и воспалительных заболеваний кишечника с помощью простого и надежного метода изучения сложного взаимодействия между нейронами и энтеральной глией с использованием визуализации кальция NC 2, демонстрируя, что эта процедура будет предоставлена ученым из моей лаборатории. Следующие процедуры с использованием тканей лабораторных животных соответствуют рекомендациям A VMA по эвтаназии животных 2013 года и были заранее одобрены Мичиганским государственным университетом I-A-C-U-C После усыпления животного в соответствии с утвержденными процедурами поместите животное в положение лежа на спине и очистите кожу над животом 70% этанолом. С помощью щипцов защемите кожу живота по средней линии, а затем хирургическими ножницами сделайте шестисантиметровый медиальный разрез вдоль линейного локтя, чтобы обнажить внутренние органы пищеварения.

Затем с помощью тупых щипцов найдите и обнажите толстую кишку внутри брюшины. Разрежьте брыжейку подвздошной кишки ножницами и начните распутывать кишечник. После того, как длина кишечника будет адекватно распущена, разрежьте толстую кишку дистальнее слепой кишки и проксимальнее прямой кишки для приготовления препарата для толстой кишки, который будет показан в этом видео.

Затем быстро удалите кишечный сегмент и поместите его в стакан, содержащий DM EMF 12 Media с добавлением трех микромолярных никардипина гидрохлорида и одного микромолярного S-скополамина гидрохлорида на льду. Добавление этих ингибиторов облегчает микродиссекцию и последующую визуализацию за счет паралича гладкой мускулатуры кишечника. Удалите небольшой четырех-шестисантиметровый сегмент нужного сегмента кишечника и поместите в чашку Петри, покрытую силовой защитой, наполненную охлажденной добавкой среды.

Затем закрепите проксимальный и дистальный концы кишечного сегмента булавками от насекомых и вскройте кишечную трубку, сделав прямой продольный надрез по брыжеечной границе. Теперь прижмите ткань под легким натяжением слизистой оболочкой вверх и осторожно рассеките слой слизистой, приподняв слизистую оболочку с помощью пяти тонких щипцов и разрезав снизу очень тонкими пружинными ножницами. Разрежьте ткань на более мелкие кусочки площадью примерно 0,5 квадратных сантиметра и поместите каждый кусочек в чашку для визуализации, наполненную добавкой, и положите на лед.

Прикрепите каждый препарат к четырем углам круговым мышечным слоем вверх. Осторожно рассеките круговую мышцу, раздразняв ее тонким пинцетом. Чтобы обнажить миентеральное сплетение, избегайте чрезмерного растяжения, поместите чашки для визуализации обратно на лед и замените раствор в каждой чашке свежими добавками.

Далее снимите посуду со льда и добавьте в каждую посуду по два миллилитра ферментной смеси и выдерживайте при комнатной температуре с 5% углекислым газом и 95% воздухом в течение 15 минут. Наконец, промойте тканевые препараты с помощью фильтрующего материала три раза и обойдите углы во время работы в условиях ограниченного освещения, чтобы избежать фотообесцвечивания при 1,5 миллилитров дополненной среды и 1,2 микролитре 250 миллимолярного пропита до 1,5 микролитра Eloqua четырех миллимоляров Fluro четырех лотков при примерно 1,5 миллилитров раствора для визуализации и инкубируйте в темном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 градусов протокол. Вынув посуду из инкубатора, трижды промыть заготовки с помощью фильтрующего материала.

Затем добавьте свежую среду, содержащую 200 микромолярной проп-кислоты для усиления мечения нейронных нейронов, и инкубируйте, как и раньше, в течение 15 минут. Во время инкубации изготовьте модифицированный буфер Кребса в соответствии с инструкциями в письменной части протокола, и добавьте три микромолярных никардипина и один микромолярный скополамин для подавления мышечных сокращений. Во время визуализации с использованием кальция два плюс и рассечения целиком камера расположена под флуоресцентным микроскопом и с помощью системы перфузии гравитационного потока с несколькими нагреваемыми резервуарами для шприцев.

Установите непрерывную скорость перфузии от двух до трех миллилитров в минуту буфера Кребса при температуре 37 градусов Цельсия. Убедитесь, что не происходит образования пузырьков воздуха как на входе, так и на всасывающей линии, подключенной к вакуумной ловушке. Сфокусируйте нужное сплетение при ярком освещении поля.

Избегайте чрезмерного обнажения ткани, которое может привести к фотообесцвечиванию. Исследуйте грипп и четыре нагрузки внутри ганглиев и выберите здоровые ганглии для визуализации. Нездоровые поврежденные ганглии будут проявлять аутофлуоресценцию или точечную морфологию и не должны использоваться для визуализации.

После того, как ганглий выбран, перенаправьте световой путь на камеру и получите живое изображение. С помощью программного обеспечения для получения изображений убедитесь, что ганглий находится в фокусе, и установите скорость получения изображения и время экспозиции. Для большинства экспериментов изображения традиционно получаются с частотой от 0,5 до одного герца для глиальных клеток и с частотой от двух до 10 герц.

Для нейронов, поскольку глиальные кальциевые переходные нейроны не так быстры, как кальциевые транзиторные нейроны, запустите запись и установите исходный уровень физиологической активности выбранного ганглия в отсутствие экспериментальных стимулов в течение 30 секунд. Затем нанесите интересующие вас препараты, такие как агонисты и антагонисты рецепторов, используя систему перфузии гравитационного потока, со скоростью два-три миллилитра в минуту в соответствии с оптимизированным для вашего препарата протоколом. Остановите запись и просмотрите покадровую съемку эксперимента.

Тщательно выбирайте области интереса или окупаемость инвестиций с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений. Наконец, используйте соответствующее программное обеспечение для визуализации для нормализации и сравнения интенсивности флуоресценции интересующих областей с ее начальным исходным уровнем Изменения значений нормализованной флуоресценции прямо пропорциональны изменениям кальция. Следующие три изображения демонстрируют, что кишечная глия у морских свинок реагирует на TP in situ.

В базальных условиях виден низкий уровень флуоресценции 4 флюоресценции, обозначенный пунктирной линией. Стрелки указывают на толстые межганглионарные волокнистые тракты при стимуляции 100 микро на литр A TP глиальных клеток, но не на нейроны быстро увеличивают флуоресценцию флуоресценции 4 мкм, что указывает на увеличение кальция. Обратите внимание, что реагирующие клетки маленькие и окружают гораздо более крупные нейроны, обозначенные темными пространствами, отмеченными звездочкой.

Эта гистограмма показывает, что энтеральная глия реагирует на ТП дозозависимым образом: один миллимоль на литр, вызывая максимальные ответы. На этом видео показан миентеральный ганглий из дистального отдела толстой кишки мыши, загруженный кальциевым двумя плюс индикаторным красителем гриппа. Агонист глиальных клеток DP добавляется в ванну по показаниям.

ДП вызывает увеличение внутриклеточного кальция два плюс в кишечной глии, что наблюдается по временному повышению флуоресценции гриппа и четыре. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно изучить сложное взаимодействие между нейронами и опытным путем использовать кальциевую визуализацию. Определение характеристик механизмов и потенциальных функциональных последствий кальциевых реакций в цельных препаратах требует точного препарирования для достижения идеального качества визуализации.

Использование флуоресцентного мечения и фармакологических стимулов в рамках этого метода, основанного на микроскопии, позволяет улучшить оценку этих клеток в их естественной многоклеточной среде.