Спинных нейронов и дифференцированных жировой стволовых клеток, полученных: In Vitro Co-культура моделью для изучения периферических нервов Регенерация

Общая цель этой процедуры заключается в создании полученных из жировой ткани стволовых клеток и ганглиозов дорсальных корешков или культур нейронов DRG для изучения регенерации нервов in vitro. Это достигается путем предварительного получения недифференцированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс. На втором этапе клетки дифференцируются в шваноподобные клетки с использованием коктейля факторов роста.

Затем нейроны DRG собираются из спинного мозга крысы и связываются на последнем этапе, нейроны размещаются на дифференцированных стволовых клетках для создания системы совместного культивирования in vitro. В конечном счете, клетки окрашиваются на нейронные и глиальные маркеры, чтобы способствовать росту нейритов, количественной оценке и визуализируются с помощью сканирующей электронной микроскопии для морфологической оценки. Этот метод может помочь ответить на различные вопросы в области регенеративной медицины, например, как жировая ткань правой стволовой клетки взаимодействует с органическими нейронами на различных биоматериалах?

Причина, по которой демонстрируется этот метод, имеет решающее значение, потому что он включает в себя шаги, которые трудно освоить из-за низкой доступности и небольшого размера тканей в биологическом шкафу. Начните с использования ножниц и стерильного лезвия бритвы, чтобы мелко нарезать висцеральный и паховый жир, собранный у взрослых самцов крыс spro dolly, до мелкой консистенции. Далее полученную жировую кашицу переложить в пробирку, содержащую 15 миллилитров свежеприготовленного фильтра, простерилизовать раствор коллагеназы первого типа и поместить пробирку в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном перемешивании на срок от 30 до 60 минут.

Внимательно следите за пищеварением, останавливаясь до того, как ткань полностью диссоциируется, чтобы улучшить жизнеспособность клеток и урожайность. Когда ткань будет готова, отфильтруйте ее через клеточное ситечко толщиной 100 микрон. Хорошее пищеварение приведет к однородной консистенции жира, которая выглядит бежевой с легким закручиванием.

Нейтрализуйте пищеварительные ферменты с помощью 15 миллилитров среды для роста стволовых клеток 37 градусов Цельсия с добавлением FBS. Затем вращают вниз клетки, чтобы собрать стромальную сосудистую фракцию. Отсасывайте супинат, начиная с верхнего слоя жира.

Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре эритроцитарного буфера ISIS с помощью пипетирования. Через одну минуту прекратите лизис, добавив 10 миллилитров свежей, среды и снова центрифугируйте в клетки. Теперь осторожно отсасывайте S-надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах среды и засейте клетки в 75 квадратных сантиметров. Колбы при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Поддерживайте клетки на субконфлюентных уровнях до первого или второго пассажа, на котором клетки готовы к дифференцировке в шваноподобные клетки путем обработки бета-большим количеством кэп-этанола и ретиноевой кислоты для получения нейронов DRG после забора спинного мозга.

Начните с удаления любых тыловых частей, а затем с помощью стерильных и острых хирургических ножниц разделите позвоночный столб пополам по продольной оси, обнажив ткани спинного мозга. Разрежьте позвоночный столб на два меньших сегмента ниже уровня грудной клетки, а затем с помощью тонких щипцов аккуратно удалите всю ткань спинного мозга. Будьте осторожны, чтобы не вытянуть и не удалить корни DRG, которые выглядят как белые нити, выходящие прямо из каналов.

После того, как вся ткань ядра будет удалена, используйте очень тонкие щипцы, чтобы вытянуть весь корень DRG, проникая глубоко в вертебельные каналы и стараясь не повредить корни ганглий. Поместите DRG в миску для домашних животных площадью 60 квадратных миллиметров, содержащую три-четыре миллилитра ветчины F 12 medium с добавлением антибиотиков. Затем под препарирующим микроскопом используйте стерильные щипцы и скальпель, чтобы удалить лишние нервные корешки, окружающие ганглии, чтобы уменьшить загрязнение сателлитных клеток.

Далее переложите DRG в чашку Петри площадью 35 квадратного миллиметра, содержащую 1,8 миллилитра свежей среды F 12 и добавьте 200 микролитров коллагеназы. Стандартный раствор четвертого типа. Инкубируйте DRG в течение одного часа, а затем осторожно отсасывайте среду с помощью стеклянной пипетки.

Заботясь о том, чтобы не вызвать аспирацию и не повредить DRG. Повторите шаг коллагеназы и промойте DRG средой F 12. После второй промывки добавьте в клетки 1,8 миллилитра среды F 12 и 200 микролитров трипсина.

Удаление трипсина и добавление одного миллилитра среды с добавлением 500 микролитров FBS для остановки ферментативной реакции. Затем отсадите средство и аккуратно промойте DRG средством F 12 три раза, чтобы удалить все следы сыворотки. Теперь накормите клетки двумя миллилитрами свежей среды F 12 и с помощью стеклянной пипетки аккуратно переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.

Проводите пипеткой вверх и вниз от восьми до 10 раз, чтобы мягко диссоциировать нейроны, а затем позвольте нёбу скопиться на дне пробирки, когда нёбо успокоится. Переложите супинат в новую пробирку и добавьте два миллилитра свежей среды F 12 во вкус. Повторение механической диссоциации и перенос среды в суспензию становятся однородными.

Затем повторно измерьте клеточную суспензию три-четыре раза с последующей фильтрацией полученной гомогенизированной суспензии через сетчатый фильтр для клеток размером 100 микрон в новую 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте клетки в пробирке объемом 15 миллилитров, пока они медленно вращаются пипеткой свежеприготовленной пипетки. 15% бычьего сывороточного альбумина вниз по внутренней стороне 15-миллилитровой пробирки, удерживаемой под углом 45 градусов для создания постепенного белкового следа.

Используя цифры на пробирке в качестве эталона для формирующейся дорожки, затем аспирируйте снац из клеток, сохраняя последние 500 микролитров для ресусси, суспензируйте гранулу и медленно дозируйте клетки по белковому следу в новую пробирку. После раскрутки ячеек, опять же, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре модифицированной BS-среды и засейте клетки в небольшом объеме среды. В 24-луночный планшет в течение двух часов, когда клетки прикрепятся, добавьте свежую BS-среду с добавлением 15 нанограммов на миллилитр фактора роста нервов после диссоциации.

Клетки DRG также могут быть использованы для совместного культивирования с жировыми стволовыми клетками, подобными лебединым клеткам, путем их посева поверх предпосевных клеток. Эти изображения демонстрируют важность жировых стволовых клеток, подобных клеткам Швана, для прорастания нейрита DRG в модели совместного культивирования с использованием поликапролактонных пленок в качестве субстратов. Невриты не наблюдались на необработанных поверхностях в отсутствие адипозных стволовых клеток, подобных лебединым клеткам, в то время как образование нейритов было явно улучшено в системе совместного культивирования.

В среднем, количество нейритов на теле клетки значительно увеличивается в присутствии стволовых клеток. Действительно, как показывают эти изображения, способность нейронов DRG проращивать нейроны происходит преимущественно в сочетании с дифференцированными стволовыми клетками, на что указывают желтые стрелки. Так что после просмотра этого видео, теперь можно получить свободное деривационное стволовые клетки и диссоциировать нейроны DGen.

Но также вы должны иметь возможность настроить модель для изучения периферической средней дегенерации.